Nome do Projeto
Plataforma Biotecnológica Oncopig Bladder Cancer (OBC): um modelo editado por CRISPRs/Cas
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
16/05/2022 - 28/02/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O presente projeto de pesquisa e desenvolvimento tecnológico faz parte de uma colaboração internacional com a University of Illinois at Chicago e com a Startup de Biotecnologia Salt Biotech. O projeto aprovado junto ao CNPq na chamada de Bolsas de Produtividade em Desenvolvimento Tecnológico com vigência ate 2025. O projeto tem como objetivos especificos: Analisar as sequências alvos, desenhar os RNAs guias e construir os plasmídeos; Estabelecer cultivo primário de células somáticas suínas; Realizar a edição gênica das células somáticas suínas cultivadas através de CRISPR/Cas9 e CRISPR/Cas12, em alvos genômicos conforme as mutações que ocorrem em humanos; Selecionar as células editadas para crescimento de clones idênticos; Confirmar a eficiência da edição dos genes através da expressão de GFP e identificar o padrão genético modificado por sequenciamento de Sanger; Ativar a expressão dos genes inseridos pela tecnologia Cre/Lox; Confirmar alteração no padrão de expressão gênica e protéica dos genes alvos editados; Estabelecer a linhagem celular editada; Utilizar a plataforma celular do no screening in vitro de quimioterápicos antitumorais; Realizar a transferência nuclear de células somáticas editadas para geração de embriões molecularmente miméticos ao câncer de bexiga; Avaliar a edição através da expressão de GFP; Criopreservar os embriões suínos humanizado e editados por CRISPRs constituindo o OBC Embryo Bank;

Objetivo Geral

Gerar um novo biomodelo humanizado in vitro, denominado OBC Embryo Bank - Oncopig Bladder Cancer, para o estudo do câncer de bexiga através da edição por CRISPR/Cas de alvos genômicos comumente alterados em neoplasias uroteliais humanas.

Justificativa

O câncer de bexiga (CB) é o décimo tumor mais frequente na população mundial, sendo o sexto câncer mais comum sendo a nona principal causa de morte por câncer entre o sexo masculino (BRAY et al., 2018). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer prevê 10.640 novos casos da doença para este ano, destes 7.590 em homens e 3.050 em mulheres (Inca, 2020). Carcinomas uroteliais representam o tipo mais frequente de CB. Englobam tumores que tiveram origem no tecido interno da bexiga, denominado urotélio, e são responsáveis por mais de 90% dos casos desta
neoplasia (ASCO, 2020). Portanto, serão o foco da presente proposta. Suínos representam um animal ideal para o desenvolvimento de tumores personalizados devido ao seu tamanho, anatomia, fisiologia, metabolismo, imunidade e genética semelhantes aos humanos. Atualmente, nosso laboratório está trabalhando na comparação da resposta citotóxica de células uroteliais humanas e suínas quando submetidas a tratamento com quimioterápicos comumente utilizados na clínica. Outras linhas de pesquisa incluem screening in vitro em células tumorais e
geração de embriões suínos para screening de moléculas inovadoras antitumorais. Não só o animal em si, mas os embriões previamente gerados no cultivo in vitro representam outra valiosa ferramenta para drug screening na etapa que antecede os estudos in vivo. Neste sentido a plataforma biotecnológica proposta leva em consideração a diminuição do número de animais, valorizando a questão ética dos 3Rs. Embriões são estruturas celulares complexas composta de células-tronco embrionárias capazes de gerar todos os tipos de células do corpo. Utilizar este modelo in vitro para compor uma plataforma de screening para avaliar potenciais efeitos citotóxicos de produtos biotecnológicos ou compostos sintéticos é um campo que merece ser explorado. As mudanças celulares sofridas pelo embrião dão insights sobre o potencial efeito biológico da molécula que está sendo testada credenciando-a para ensaios pré-clínicos in vivo no modelo editado para câncer de bexiga. A presente temática vem sendo abordada pelo grupo em uma série de publicações que merecem destaque:
Editorial: Building Strategies for Porcine Cancer Models.
Collares T, Seixas FK, Rund LA, Schook LB.Front Genet. 2018 Oct 2;9:377. doi: 10.3389/fgene.2018.00377. eCollection 2018.

The Oncopig Cancer Model as a Complementary Tool for Phenotypic Drug Discovery.
Segatto NV, Remião MH, Schachtschneider KM, Seixas FK, Schook LB, Collares T. Front Pharmacol. 2017 Dec 5;8:894. doi: 10.3389/fphar.2017.00894. eCollection 2017.

Emerging Technologies to Create Inducible and Genetically Defined Porcine Cancer Models.
Schook LB, Rund L, Begnini KR, Remião MH, Seixas FK, Collares T. Front Genet. 2016 Feb 29;7:28. doi: 10.3389/fgene.2016.00028. eCollection 2016.

A Genetic Porcine Model of Cancer.
Schook LB, Collares TV, Hu W, Liang Y, Rodrigues FM, Rund LA, Schachtschneider KM, Seixas FK, Singh K, Wells KD, Walters EM, Prather RS, Counter CM. PLoS One. 2015 Jul 1;10(7):e0128864. doi: 10.1371/journal.pone.0128864. eCollection 2015.

Unraveling the swine genome: implications for human health.
Schook LB, Collares TV, Darfour-Oduro KA, De AK, Rund LA, Schachtschneider KM, Seixas FK. Annu Rev Anim Biosci. 2015;3:219-44. doi: 10.1146/annurev-animal-022114-110815. 2015

Metodologia

Genes alvo;
Vetores para a Edição gênica por CRISPRs/Cas;
Reparação Homóloga (RH);
Transferência Gênica em fibroblastos suínos;
Seleção de um única célula (Single Cell);
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
Ativação da expressão gênica;
Ensaio de Western Blot;
Sequenciamento;
Transferência Nuclear de Células Somáticas;
Microscopia Confocal;
Criopreservação dos embriões suínos - OBC Embryo Bank;





Indicadores, Metas e Resultados

A pesquisa científica de qualidade apresenta desafios, os quais motivam a busca cada vez maior pela excelência. A equipe executora do trabalho, a qual reúne qualificações e expertises complementares, será fundamental para a execução do projeto. Com o desenvolvimento desta pesquisa, esperamos alcançar a obtenção e a validação de um modelo robusto ao estudo do câncer de bexiga humano.

1. Publicar pelo menos 6 artigos científicos em jornais de circulação internacional de alto impacto;
2. Depósito de patente internacional em colaboração com as instituições parceiras;
3. Co-desenvolvimento das tecnologias geradas em colaboração com STARTUPs de base biotecnológica vinculadas a proposta no Brasil e nos Estados Unidos;
4. Geração de recursos humanos já em andamento junto ao Programa de
Pós-graduação em Biotecnologia (Capes 7) da UFPel sendo 2 teses de doutorado sob a orientação do coordenador do projeto.

As ações de formação de recursos humanos e colaboração internacional foram fortalecidas pelo CAPES-Print a partir de através da missão junto a University of Illinois at Chicago – Incubator Laboratory Facility no Illinois Medical District.

Link da missão:
(https://wp.ufpel.edu.br/print/2019/08/21/pesquisadores-fabiana-seixase-tiago-collares-participaram-de-missao-institucional-capes-print-ufpelnos-estados-unidos/).

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
BRUNA SILVEIRA PACHECO
FABIANA KOMMLING SEIXAS2
ISADORA ANDRÉ ROSA LOPES
JÚLIA DAMÉ FONSECA PASCHOAL
TIAGO VEIRAS COLLARES4

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