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O projeto de pesquisa aqui proposto possui originalidade devido seu ineditismo, já que não existem dados a respeito da validação de genes de referência na espécie de peixe Austrolebias charrua, espécie endêmica e ameaçada de extinção que está entre as espécies-chave para acompanhamento e proteção dos rivulídeos ameaçados de extinção, segundo o Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio). Tal validação se faz importante já que a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) é largamente utilizada para estudos de expressão gênica, e pode vir a ser melhor explorada em estudos com peixes-anuais. A normalização de qPCR com falsos genes de referência conduzem o pesquisador ao erro de interpretação dos resultados encontrados, o que se torna muito preocupante, visto o gasto de tempo, dinheiro e amostras biológicas para obtenção de dados irreias.
Pelo motivo de ser impossível encontrar bons genes de referência que sirvam para todas as espécies e para todas as condições experimentais, se torna necessária a pesquisa dos melhores candidatos a genes de referência na espécie objeto de estudo, A. charrua. Para tal espécie, ainda não existem dados disponíveis sobre expressão ou sequencias gênicas de genes de referência. Os resultados provindos da pesquisa proposta servirão de base para o desenvolvimento de projetos futuros que visam, por exemplo, o desenvolvimento de uma tecnologia de avaliação de biomarcadores em peixes-anuais.
Além disso, o próprio sequenciamento de diversos genes dessa espécie se mostra relevante, pois aumenta e disponibiliza para o público o conhecimento sobre o patrimônio genético nacional. Ainda, este projeto irá contribuir com o melhor entendimento sobre a biologia geral e a criação em cativeiro de A. charrua.
Essa aplicabilidade representa um primeiro passo essencial para o desenvolvimento de uma tecnologia de avaliação de biomarcadores em peixe-anual, potencializando uma futura transferência de tecnologia. Com isso, ela pode vir a contribuir para o avanço e consolidação do desenvolvimento tecnológico, econômico e sociocultural do país, gerando negócios, receita e empregos.
Por fim, esta proposta possui um caráter estimulador e formador de recursos humanos para a inovação, visto que abre os horizontes dos alunos envolvidos para a aplicabilidade de estudos biológicos pelo mercado.

1. Identificação, clonagem e sequenciamento dos genes de referência
Tendo em vista que os genes de interesse para este projeto ainda não foram sequenciados, faz-se necessário que uma série de procedimentos sejam realizados a fim de se conhecer objetivamente as suas sequências. Após o sequenciamento dos genes, a equipe proponente estará apta a desenvolver os experimentos que avaliarão os níveis de expressão de cada um dos genes candidatos em diversos tecidos, após a exposição de peixes de ambos os sexos ao herbicida Roundup.
1.1. Animais e condições de criação
Os indivíduos da espécie Austrolebias charrua em estágio adulto serão coletados em poças temporárias nos campos costeiros próximos à orla da praia do Cassino, Rio Grande do Sul, Brasil (32°2'6"S, 52°5'56"O). A captura será realizada através de varreduras com puçás com abertura de malha de 4 mm. Serão coletados 24 animais, sendo 12 machos e 12 fêmeas, que serão prontamente transferidos para tanques com água coletada no ambiente e devidamente aerada. Os animais serão transportados até o Biotério de Biomodelos Aquáticos da UFPEL, onde serão aclimatados durante 3 semanas sob aeração constante, temperatura de 21 °C e fotoperíodo de 12h/12h, de acordo com Volcan et al., 2013.
1.2. Coleta dos tecidos
Após a captura com uso de puçá, cada animal será submerso em solução a 4ºC para ser eutanasiado pelo método de resfriamento rápido. Detectados os sinais de morte do animal que são a perda completa de equilíbrio e do movimento opercular, o animal prosseguiu para a coleta de tecidos.
A necropsia do animal será feita em placa de petri esterilizada, utilizando tesoura e bisturi. Amostras de cérebro, brânquias, gônadas e fígado foram coletadas, acondicionadas em criotubos e mantidas em nitrogênio líquido (N2) até a extração de RNA.
1.3. Extração e quantificação de RNA
Os criotubos contendo as amostras coletadas serão retirados do N2 e descongelados sob temperatura de refrigeração (4°C). Posteriormente as amostras serão usadas para extração de RNA com kit comercial RNeasy® Mini Kit , baseado em cromatografia de troca iônica. Os procedimentos serão realizados conforme as instruções do fabricante. Após a extração, o RNA será quantificado por espectrofotometria através do equipamento NanoVueTM Plus (GE Healthcare Life Science, EUA), utilizando absorbância no comprimento de onda de 260nm. Já a pureza das amostras será avaliada por meio da razão entre as absorbâncias obtidas em 260nm e 280nm (razão A260/A280). Serão consideradas puras as amostras que apresentarem valores iguais ou superiores a 2,0. Após a realização das quantificações, apenas as amostras consideradas puras e com volume suficiente serão utilizadas.
1.4. Confecção do cDNA
Para a confecção do cDNA a partir das amostras de RNA, será utilizado o kit comercial High Capacity cDNA Reverse Transcription . Os procedimentos serão realizados conforme as instruções do fabricante. As reações de transcrição reversa ocorrerão em equipamento termociclador SimpliAmp™ os parâmetros de incubação serão de 25°C por 10min para a ativação inicial da enzima transcriptase reversa, sendo logo após submetidas à 37°C por 120min para a síntese do cDNA, seguido por inativação da enzima a 85°C por 5min e finalizando a ciclagem sob 4°C constante. Ao término do processo, as amostras serão armazenadas à -20°C até serem utilizadas posteriormente.
1.5. Desenho dos primers
Visto que os genes de interesse desse projeto não são conhecidos em A. charrua, antes da confecção dos primers serão realizados alinhamentos de sequências gênicas conhecidas e depositadas no Genbank® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) a fim de identificar regiões conservadas, as quais são bons pontos para guiar a composição nucleotídica dos primers de interesse. Os alinhamentos e desenho de primers serão realizados com auxílio da ferramenta online PriFi . A pesquisa de homodímeros de primers e hairpins loops (estruturas secundárias indesejadas) será realizada com o software Vector NTI Advance™ 11.0. A pesquisa de heterodímeros será realizada através da ferramenta online Multiple primer Analyzer (www.thermofisher.com).
1.6. Amplificação e clonagem dos fragmentos gênicos por PCR
O cDNA confeccionado previamente a partir do RNA extraído, bem como os primers engenheirados, serão usados nas PCRs. Para preparação das reações foi usado o mix buffer GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase segundo as instruções do fabricante. A amplificação clonal dos fragmentos gênicos ocorrerá em termociclador SimpliAmp™ . Os parâmetros de incubação são incertos, uma vez que tal metodologia ainda não está padronizada devido ao fato de tais genes ainda não terem sido sequenciados na espécie alvo. Após as reações de PCR, a amplificação será confirmada por eletroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR serão inseridos em vetor de clonagem pCR™4-TOPO® TA, os quais serão utilizados para transformar bactérias Escherichia coli da linhagem DH5α eletrocompetentes. Os procedimentos serão realizados de acordo com as especificações do fabricante.
1.7. Purificação do fragmento de interesse nos plasmídeos
A partir de colônias contendo o vetor TOPO com o fragmento de interesse,* serão feitos inóculos de cultura bacteriana em 3mL de meio LB líquido, contendo o antibiótico canamicina. O vetor será isolado e purificado utilizando o kit comercial llustra plasmidPrep Mini Spin, seguindo instruções do fabricante.
1.8. Sequenciamento
As amostras purificadas a partir dos géis serão, então, submetidas ao sequenciamento por método de Sanger automatizado. Será utilizado o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing, para a amplificação exponencial da região de interesse através do uso de primers específicos e pela adição de dNTPs e ddNTPs. Os procedimentos serão realizados conforme as instruções do fabricante. Depois de prontas, as placas de 96 poços contendo as soluções de amplificação para sequenciamento serão incubadas no termociclador SimpliAmp™ sob os seguintes parâmetros: aquecimento inicial a 96 °C por 1 min; 35 ciclos de aquecimento a 96 °C por 1 min, resfriamento rápido (1 °C/seg) até 50 °C por 5 seg, reaquecimento rápido (1 °C/seg) até atingir 60 °C por 4 min e, por fim, resfriamento rápido (1 °C/seg) até 4 °C até as amostras serem retiradas do equipamento. Para purificação será usado o kit BigDye® XTerminator™ Purification conforme as instruções do fabricante. Com as amostras devidamente purificadas, o sequenciamento será realizado pelo equipamento Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer®, conforme as instruções do fabricante.
Com o sequenciamento terminado será possível conhecer a composição nucleotídica dos genes de interesse. Tais sequências serão devidamente depositadas no banco de dados internacional, GenBank®, tornando-as disponíveis gratuitamente a qualquer pesquisador que deseje conhecer, interpretar e utilizar as sequências para os mais diversos fins.
2. Fase experimental – determinação da eficácia dos genes de referência
Com os genes devidamente sequenciados e com sua estrutura conhecida a equipe proponente poderá passar à fase de experimentação. Nessa fase é proposto o experimento de avaliação dos níveis de expressão gênica dos genes de referência após a exposição dos peixes ao herbicida Roundup.
2.1. Experimento: Avaliação de genes constitutivos como normalizadores para análises PCR em tempo real da expressão gênica em Austrolebias charrua submetidos ao estresse por Roundup
2.1.1. Animais e condições de criação
Os animais utilizados neste experimento, bem como suas condições de criação, serão os mesmos descritos na seção 1.1. deste documento.
2.1.2. Desenho experimental
Durante o período experimental, os animais serão mantidos na mesma distribuição e sob as mesmas condições da aclimatação. O experimento contará com grupo “controle”, com 1 tanque (contendo 3 machos e 3 fêmeas), e grupo “Roundup” na concentração de 5 mg/L (equivalente ácido de glifosato), com 1 tanque contendo 3 machos e 3 fêmeas. A exposição será realizada de forma aguda por um período de 24 h. O experimento será realizado em duplicata. Ao final do período de exposição, serão coletadas amostras de cérebro, brânquias, fígado e gônadas. Os tecidos serão armazenadas em nitrogênio líquido (-196 °C) para serem utilizadas na etapa de extração de RNA.
2.1.3. Coleta dos tecidos
A coleta dos tecidos será realizada conforme o exposto na seção 1.2. deste documento.
2.4. Extração e quantificação de RNA
A extração e quantificação do RNA das amostras será realizada conforme exposto na seção 1.3. deste documento.
2.5. Confecção do cDNA
A confecção do cDNA a partir do RNA extraído dos tecidos coletados será realizada conforme o exposto na seção 1.4. deste documento
2.6. Desenho dos primers para qRT-PCR
A confecção dos primers será baseada nas sequências parciais dos genes sequenciados. Todos os primers serão desenhados usando a ferramenta online Primer3 (www.bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) e sintetizados por empresa terceirizada. Os produtos preditos de amplificação das reações de qRT-PCR devem estar entre 120-200 pb de comprimento. O coeficiente de correlação (R2) será determinado com base nos slopes das curvas padrão geradas por diluições seriadas de cDNA. Um valor para R2 acima de 0,98 será considerado aceitável.
2.7. Análise da expressão gênica por PCR em tempo real
As reações de PCR em tempo real ocorrerão no equipamento CFX96™ Real-Time PCR Detection System e serão preparadas usando o mix SYBR® Green PCR Master Mix. Uma validação inicial será realizada para garantir que todos os pares de primers tenham eficiências equivalentes.
2.8. Análise estatística
A diferença estatística entre os valores médios será pesquisada por análises de variância de duas vias (two-way ANOVA) seguidas por teste de Tukey com níveis de significância de 95%. O software estatístico utilizado será o Statistix v. 10.0. Os gráficos representativos dos resultados quantitativos serão gerados através do software GraphPad Prism v. 5.0.

A presente proposta apresenta originalidade e relevância científica, visto que, além de contribuir com o primeiro sequenciamento e depósito em banco de dados internacional de vários genes de referência de A. charrua, busca proporcionar incremento numa das principais técnicas utilizadas atualmente na quantificação da expressão gênica de diversas espécies. A técnica de PCR em tempo real tem sido a mais utilizada na quantificação da expressão gênica ao redor do mundo e conta com benefícios como rápida possibilidade de leitura, alta eficiência e alto grau de automatização, sendo a atual técnica padrão-ouro. Porém, o método de quantificação relativa depende de genes normalizadores apropriados para que não haja equívocos na interpretação dos dados obtidos. Neste projeto, é proposto pela primeira vez que diferentes genes de A. charrua sejam clonados e selecionados como bons normalizadores para as reações de qRT-PCR, gerando subsídios para técnicas moleculares aplicadas ao monitoramento ambiental desta espécie em extinção. O projeto propõe a determinação de genes de referência para diferentes tecidos, em animais machos e fêmeas, e sob exposição do contaminante Roundup®, objetivando testar a constância da expressão dos genes candidatos.
Esse conjunto de resultados permitirá incremento significante no conhecimento sobre genética, fisiologia e zootecnia desses animais e abrirá possibilidades de desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para o monitoramento ambiental de ambientes aquáticos contaminados por herbicidas. Ou seja, os resultados subsidiarão tanto a ciência básica quanto a ciência aplicada. Assim, espera-se ao final deste projeto pelo menos a publicação de um artigo científico em periódico internacional, além do depósito em banco de dados internacional de todos os genes sequenciados durante o desenvolvimento do projeto.