Nome do Projeto
DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA CONTRA ENTEROPATIA PROLIFERATIVA E SALMONELOSE EM SUÍNOS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
05/07/2022 - 05/07/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A suinocultura representa um importante setor para a economia brasileira, tornando relevante o desenvolvimento de insumos que diminuam o ônus de infecções bacterianas na produção de suínos. A Enteropatia Proliferativa (EP) é causada por Lawsonia intracellularis e apresenta alta prevalência em suínos. É caracterizada por diarreia hemorrágica, diminuição do crescimento e das taxas reprodutivas dos animais, e ainda, favorece o estabelecimento de infecções por Salmonella spp. em suínos. Salmonella spp. é o principal patógeno responsável por doenças de origem alimentar em todo o mundo, sendo a carne suína uma frequente fonte de infecção. A medida profilática mais eficiente para o controle de doenças infecciosas é através da vacinação, contudo as vacinas disponíveis contra EP apresentam limitações relacionadas a proteção, efeitos adversos e dificultam o diagnóstico diferencial de animais vacinados e infectados. O desenvolvimento racional de vacinas através de vacinologia reversa permite a seleção de epítopos específicos, conservados nos diversos sorovares e capazes de estimular resposta imune específica. Contudo, devido a pureza do antígeno é necessário alia-lo a adjuvantes ou sistemas de entrega. Neste contexto, este projeto visa desenvolver uma vacina contra Enteropatia Proliferativa e Salmonelose em suínos utilizando Salmonella viva atenuada como sistema de entrega de antígenos específicos de L. intracellularis. Estudos de vacinologia reversa, realizados pelo nosso grupo de pesquisa, destacam uma proteína conservada em todas as cepas de L. intracellularis, a qual apresenta 98% de similaridade do gene 16S-rDNA da cepa de suíno com as outras estirpes, trata-se de uma proteína reconhecida pelo soro de suínos infectados, sugerindo uma expressão consistente pela bactéria L. intracellularis e indica que esta proteína apresenta a capacidade de ativar o sistema imune hospedeiro. Células de Salmonella serão transformadas com o plasmídeo contendo a sequência para expressão da proteína previamente selecionada. Ensaios in vivo, visando avaliar a capacidade da vacina de estimular resposta imune específica serão realizados em camundongos e, posteriormente, em suínos. Após a vacinação serão realizadas coletas semanais de amostras de sangue, para análises sorológicas, e de fezes, para a identificação de L. intracellularis e Salmonella por qPCR. A resposta imune humoral será verificada por ELISA indireto detectando a presença de anticorpos IgA, IgG e seus isotipos, enquanto que a resposta celular será caracterizada através do cultivo de esplenócitos e quantificação da transcrição de citocinas. O desenvolvimento de uma única vacina que proteja suínos contra Enteropatia Proliferativa e Salmonelose, e que possa ser administrada de forma oral é relevante à suinocultura, pois além de reduzir as perdas decorrentes das infecções, também tornará menos onerosa e cara a prevenção das doenças.

Objetivo Geral

Desenvolver uma vacina contra Enteropatia Proliferativa e salmonelose em suínos utilizando Salmonella viva atenuada como sistema de entrega de antígenos específicos de L. intracellularis

Justificativa

Infecções causadas pela bactéria intracelular Lawsonia intracellularis, a qual apresenta distribuição global e prevalência de 57 a 100% em todo o mundo (McORIST et al., 2003), causam uma perda econômica significativa no suinocultura (JENSEN, 2006). A vacinação contra L. intracellularis é a medida profilática mais eficiente e promissora para o controle da doença, contudo as vacinas atualmente disponíveis são baseadas na bacterina ou em células vivas atenuadas de L. intracellularis, as quais exigem cultivo em larga escala em culturas celulares em suspensão, tornando a sua produção onerosa. Em alguns casos, como em suínos alojados em sistemas com cama, a vacina atenuada não estimulou resposta imune eficaz (HOLYOAKE et al., 2009), falhas na indução de imunidade esterilizante foram observadas e geralmente são
necessárias intervenções adicionais para controlar a doença (KRUSE et al., 2016). Nesse contexto torna-se essencial o desenvolvimento de novas vacinas contra EP em suínos.
Além da alta prevalência de L. intracellularis as infecções por Salmonella são endêmicas na suinocultura em muitos países. A Salmonella é o principal responsável por doenças de origem alimentar em todo o mundo (KIRK et al., 2015), sendo a carne suína uma importante fonte de infecção (PIRES et al., 2014), responsável por aproximadamente 25% das salmoneloses em humanos (KIRK et al., 2015). Estudos indicam que a coinfecção com as duas bactérias, L. intracellularis e Salmonella seja frequente (BELOEIL et al., 2004), visto que a infecção por L. intracellularis causa o aumento da expressão de IL-8 e TNFα e o aumento na expressão destas citocinas inflamatórias pode ser um mecanismo pelo qual L. intracellularis favorece a infecção por S. Typhimurium (LEITE et al., 2019). Dessa forma a vacinação contra L. intracellularis também contribui para a diminuição das infecções causadas por Samonella enterica (LEITE et al., 2018). Portanto, é necessário uma nova estratégia de intervenção contra L. intracellularis e S. Typhimurium para reduzir o ônus de doenças bacterianas entéricas durante a produção de suínos.

Metodologia

Construção vacinal (S-Li)
O plasmídeo sintético pet/28a contendo a sequência dos antígenos de L. intracellularis, selecionados através de vacinologia reversa, fusionado à molécula LTB será usado para transformar, através de eletroporação, células de S. Choleraesuis e Typhimurium. Após o processo de transformação, através de eletroporação, as células recombinantes serão selecionadas em placa contendo o meio ágar Luria Bertani (LB) suplementado com 100 μl/mL-1 de canamicina. Um clone recombinante será selecionado para inocular 25 mL de LB contendo 100 μg/mL-1 de canamicina. O cultivo será incubado sob agitação orbital (200 rpm) a 37 °C por aproximadamente 16 h. Esta cultura será utilizada para inocular 500 mL de LB. O inóculo será incubado, sob as condições já descritas, até atingir densidade ótica a 600 nm (D.O 600) entre 0,6 – 0,8 e então será realizada a indução da expressão da proteína recombinante. Após o período de incubação a cultura será centrifugada a 8000 g por 15 min a 4 °C e o pellet será lavado três vezes com solução salina fosfatada (PBS) a fim de remover o meio de cultivo.
Avaliação da expressão dos antígenos recombinantes (rLi)
Para avaliar se a proteína recombinante foi expressa amostras da cultura submetida à expressão e amostras de Salmonella não transformadas serão submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10 %. A avaliação da expressão será realizada pela comparação do perfil de proteínas, visualizado pela presença de bandas no gel, antes e após o processo de expressão. A confirmação da expressão será realizada através da técnica Western blot. Neste teste, brevemente, as proteínas serão transferidas do gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose. Será adicionada à membrana uma solução contendo o anticorpo monoclonal anti-histidina (Sigma-Aldrich), o qual se ligará na cauda de histidina presente na construção da proteína recombinante. Posteriormente, anticorpos polivalentes de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) serão adicionados à membrana. Todas as reações dos anticorpos serão realizadas à 25 °C sob agitação orbital por 1 h, e entre cada etapa a membrana será lavada por 3 vezes com PBS-T. A visualização das reações será realizada pela adição de uma solução cromógena contendo DAB (tetrahidrocloreto de 3,3’-diaminobenzedina).
Quantificação e caracterização
A concentração de Salmonella será determinada através de diluição seriada em placas de LB e posterior contagem de colônias. Para a quantificação do antígeno recombinante, estas serão purificadas através de um sistema de cromatografia de afinidade ao níquel. A purificação será analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Em seguida, a concentração das proteínas recombinantes será determinada por quantificação através do kit BCA Protein Assay (PIERCE), utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão. A vacina (S-Li) será caracterizada através da técnica de Western blot, onde, após a transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose, esta será incubada com o soro de suínos positivos para L. intracellularis e posteriormente adicionado o anticorpo IgG anti-pig conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich). A técnica será desenvolvida conforme descrito anteriormente.
Vacinação e desafio
Para verificar a imunogenicidade da construção vacinal e determinar a dose e a estratégia de administração da vacina (via oral, intramuscular ou subcutânea) será realizado um ensaio preliminar no modelo experimental camundongo (Balb/C). Posteriormente, suínos, modelo alvo, serão vacinados com a estratégia com melhor efeito no ensaio preliminar. De acordo com a formulação vacinal os animais serão divididos em 5 grupos contendo 8 animais em cada: 1) S-Li; 2) rLi purificada; 3) Bacterina contra salmonelose® (Boehringer); 4) Bacterina comercial contra EP®(Boehringer); 5) Controle (solução salina). Os animais serão vacinados duas vezes com intervalo de 21 dias entre as doses. A dose vacinal será de 100 µg em camundongos e 400 µg do antígeno recombinante administradas em suínos. Amostras de sangue para avaliação sorológica serão coletadas com intervalo de 7 dias até o final do experimento.
Posteriormente, 21 dias após a última dose vacinal, camundongos e suínos serão desafiados via oral com 1x108 células de L. intracelulares e Salmonella spp. Após o desafio os animais serão monitorados para a observação de sinais de diarreia, comportamento, sobrevivência e perda de peso. Serão realizadas coletas periódicas de amostras fecais para quantificar células de L. intracellularis e Salmonella spp. e então, avaliar a indução de imunidade protetora.
Avaliação da resposta imune
A resposta imune humoral será verificada através da técnica de ELISA indireto, utilizando como antígeno: S-Li; células inteiras de L. intracellularis; células inteiras de Salmonella; proteína rLi purificada. Brevemente, as placas de poliestireno serão impregnadas com os antígenos, e então adicionados os soros dos animais vacinados. Posteriormente, será adicionado o anticorpo secundário espécie específico (anti-mouse ou anti-pig) conjugado com peroxidase. A concentração dos antígenos e diluição dos soros será determinada em ensaios de checkerboard. Serão quantificadas as imunoglobulinas IgA e IgG e seus isotipos. Entre cada etapa, as placas serão incubadas por 1 h a 37 °C e lavadas com solução salina fosfatada contendo Tween 20 (PBS-T). A visualização da reação antígeno-anticorpo será realizada com a adição de solução cromógena contendo ortofenilenodiamina (OPD).
Para verificar a resposta imune celular serão coletados esplenócitos de camundongos e suínos, e amostras de células da mucosa do trato gastrointestinal de suínos. Também será realizado o isolamento e cultivo de células polimorfonucleares (PBMC) obtidos a partir de sangue periférico total. As células serão cultivadas e estimuladas com os antígenos S-Li; L. intracellularis e Salmonella spp., como controle será utilizada a lectina Concanavalina A e o próprio meio de cultivo. Será realizada a extração do RNA total, a síntese de cDNA e então, a quantificação da transcrição do mRNA das citocinas IL-4, IL-8, IL-17 e IFN-y através de PCR quantitativo.
Para analisar a capacidade da vacina S-Li de induzir imunidade protetora e/ou esterilizante contra Enteropatia Proliferativa e Salmonelose, será realizada a quantificação dos respectivos agentes patogênicos em amostras fecais. Para isso, será realizada a extração de DNA das amostras, e posterior amplificação de genes específicos de L. intracellularis e Salmonella spp. por qPCR.

Indicadores, Metas e Resultados

Ao final do primeiro trimestre pretende-se obter quantidade suficiente dos antígenos recombinantes para os ensaios de imunogenicidade e proteção nos experimentos in vivo, bem como a caracterização dos antígenos in vitro;
Os estudos no modelo experimental camundongo serão indicadores da imunogenicidade da construção e do potencial vacinal de induzir uma resposta protetora contra a infecção;
A vacinação e posterior desafio de suínos permitirão determinar a imunogenicidade da vacina e a capacidade de indução de imunidade protetora e esterilizante contra Enteropatia Proliferativa e salmonelose;
Enfim, acredita-se que as taxas de infecção por L. intracellularis e Salmonella spp. reduzirão significativamente nas varas vacinadas, impactando economicamente no setor.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
MAYARA CAETANO ABREU
NEIDA LUCIA CONRAD
RENAN EUGÊNIO ARAUJO PIRAINE
VITÓRIA SEQUEIRA GONÇALVES

Página gerada em 17/04/2024 00:52:29 (consulta levou 0.216953s)