Nome do Projeto
Utilização de esporos de Bacillus sp p como sistema de entrega de antígenos vacinais
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/06/2022 - 01/06/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A vacinação é a medida profilática mais promissora e eficiente para o controle de doenças infecciosas. Vacinas recombinantes têm apresentado resultados promissores e são mais seguras quando comparadas a vacinas vivas atenuadas. No entanto, podem ser pouco imunogênicas, tornando necessário o uso de adjuvantes. O potencial do uso de esporos de bactérias do gênero Bacillus vem sendo avaliados como adjuvantes vacinais, pois os antígenos podem ser adsorvidos à superfície dos esporos em condições de baixo pH, por interações hidrofóbicas e eletrostáticas entre o esporo e o imunógeno. Dessa forma, o objetivo deste projeto é avaliar o efeito de uma vacina contra o BoHV-5, contendo a glicoproteína D recombinante como antígeno modelo, e o vírus inativado BoHV-5 adsorvidos à superfície de esporos de microrganismos Bacillus spp. em camundongos. Os animais serão vacinados com diferentes formulações vacinais contendo a glicoproteína D recombinante (rgD) e o vírus inativado BoHV-5 adsorvidos a esporos de Bacillus spp. A resposta imune humoral será avaliada através da técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) utilizando soros dos animais e a resposta celular será avaliada pela técnica de PCR em tempo real (qPCR) através da quantificação da expressão relativa de genes de citocinas de cultivo celular de esplenócitos.

Objetivo Geral

O projeto tem como objetivo avaliar o efeito de uma vacina contendo a glicoproteína D recombinante e o vírus inativado BoHV-5 adsorvidos à superfície de esporos dos microrganismos Bacillus spp. em camundongos.
Objetivos específicos:
- Adsorver os antígenos rgD e BoHV-5 na superfície dos esporos de subespécies de Bacillus spp.

Justificativa

A vacinação é a medida profilática mais promissora e eficiente para o controle de doenças infecciosas. As vacinas convencionais, baseadas em células bacterianas inteiras inativadas ou atenuadas, apresentam alta imunogenicidade, no entanto podem apresentar limitações como especificidade aos sorovares presentes em sua constituição, bem como alguns efeitos adversos em consequência principalmente do lipopolissacarídeo (LPS). Vacinas de subunidade recombinante, constituídas de epítopos específicos selecionados através de vacinologia reversa, apresentam resultados promissores e são mais seguras quando comparadas a vacinas vivas atenuadas, pois não causam reações adversas, como o risco de reversão a virulência e reação local. No entanto, devido a pureza do antígeno, podem ser pouco imunogênicas, tornando necessário o uso de adjuvantes.
O BoHV-5 é o agente etiológico da meningoencefalite herpética dos bovinos. Vacinas de subunidade contra os herpesvírus são desenvolvidas baseadas nas principais glicoproteínas do envelope viral que são responsáveis pela ligação e penetração do vírus na célula e também medeiam as respostas imunológicas do hospedeiro a infecção. A glicoproteína D é essencial para penetração do vírus nas células hospedeiras. Neste trabalho vamos utilizar formulações vacinais contendo a glicoproteína D recombinante (rgD) de BoHV-5 e o vírus BoHV-5 inativado adsorvidos na superfície de esporos de Bacillus spp. e administrar as vacinas nos camundongos.
Esporos são estruturas metabolicamente quiescentes e extremamente resistentes, produzidas por algumas bactérias em resposta a condições ambientais adversas. Devido a sua alta estabilidade, os esporos podem sobreviver neste estado de dormência por longos períodos, resistindo a altas temperaturas, radiação ultravioleta, desidratação e escassez de nutrientes Os esporos são capazes de ativar os receptores Toll-like (TLR) expressos em células dendríticas (DCs) e induzir uma forte resposta imune humoral e celular no hospedeiro. Estudos demonstraram que antígenos vacinais podem ser adsorvidos à superfície dos esporos em condições de baixo pH, por interações hidrofóbicas e eletrostáticas entre o esporo e o imunógeno.
A capacidade dos esporos de serem utilizados como sistema de apresentação e entrega de antígenos vacinais, adsorvendo o antígeno na sua superfície, já foi abordada na literatura, obtendo resultados promissores. Camundongos imunizados pela via oral e nasal com antígenos adsorvidos a esporos de B. subtilis tornaram-se protegidos contra a toxina do tétano e a toxina alfa de Clostridium perfringens. Esporos inativados de B. subtilis obtiveram resultados promissores como adjuvante de mucosa em camundongos vacinados contra o vírus Influenza. Os esporos foram capazes de adsorver o vírus H5N1 e quando administrados via intranasal, os esporos estimularam a produção de altos níveis de IgG2a e aumento de citocinas como IFN-γ, IL-2 e IL-6, indicando o desenvolvimento de uma resposta Th1/Th2 balanceada. Esporos inativados de B. atrophaeus foram utilizados para adsorver o vírus da raiva e testados como adjuvante juntamente com a saponina em camundongos. A associação dos esporos com o vírus adsorvido mais a adição de saponina estimularam altos níveis de anticorpos neutralizantes, quadriplicando o valor quando comparados a administração dos adjuvantes separadamente.
Acreditamos que é de grande importância dar continuidade a estas pesquisas, pois, a avaliação da resposta imunológica gerada pela vacina contendo a adsorção dos antígenos vacinais no esporos é importante para a elucidação dos mecanismos de ação ativados pelos esporos e os resultados alcançados poderão gerar dados científicos sobre este assunto, enriquecendo a literatura disponível.

Metodologia

Produção dos esporos de B. thuringiensis
Os microrganismos Bacillus spp. que serão utilizados neste experimento pertencem à coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia do Núcleo de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Inicialmente, cada microrganismo será semeado em placas contendo ágar BHI (Brain Heart Infusion, Difco) e incubado por 24 horas a 37 °C. Após o crescimento, colônias isoladas serão inoculadas em Erlenmayers de 125 mL contendo 10 mL de meio LB (Luria-Bertani) e incubados em agitador orbital por 18 horas a 37 °C com agitação constante de 200rpm. Esses cultivos serão inoculados em 90 mL de meio F (FOERSTER & FOSTER, 1966) e incubados em agitador orbital por 96 horas a 37 °C. Os cultivos serão centrifugados a 10.000 x g em centrífuga Sorvall® RCTM durante 10 minutos, lavados 1x com solução salina fosfatada (PBS) e após nova centrifugação nas mesmas condições, concentrados a um volume final de 20 mL. Após, a suspensão final é aquecida 68 °C em banho maria por 3 horas para eliminação de células vegetativas.
Adsorção dos antígenos
O herpesvírus BoHV-5 e a proteína rgD serão utilizados para adsorção na superfície dos esporos dos microrganismos Bacillus spp. de acordo com protocolo já descrito anteriormente (SOUZA et al., 2012). Cada subespécie será utilizada para adsorver tanto o vírus inativado BoHV-5 quanto a proteína rgD. Brevemente, serão utilizados 2 μg da proteína rgD e 10 Doses Infectantes (DI) do vírus BoHV-5, que serão adicionados em um volume final de 200 μL de PBS pH 4.0 contendo 2x109 UFC de esporos de Bacillus spp. e incubados por 1 hora a temperatura ambiente sob agitação. A solução será centrifugada por 1 minuto a temperatura ambiente e lavada 2x com PBS pH 4.0 e após, ressuspendida em um volume final de 200 μL de PBS.
Ensaios in vivo
Serão utilizados 84 camundongos Swiss, fêmeas de 4 a 6 semanas de idade, provenientes do Biotério Central da UFPel. Os animais serão alojados em gaiolas de polipropileno de 414x344x168mm autoclaváveis (ALESCO, Brasil), sem restrição de alimentação ou água. Todos os procedimentos realizados estarão de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da UFPel. As vacinas serão formuladas utilizando a glicoproteína D recombinante (rgD) de Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) expressa na levedura Pichia pastoris (DUMMER et al., 2009) e o vírus BoHV-5 inativado. As vacinas serão formuladas com a adsorção de 40 μg de rgD e 10 DI de BoHV-5 a 2x109 UFC de esporos de Bacillus spp. e 10% de Hidróxido de Alumínio (alumen) (Sigma-Aldrich). A tabela 1 apresenta os grupos experimentais do trabalho.
Amostras de sangue serão coletadas a partir da punção do plexo venoso submandibular nos dias 0, 14, 21, 28, 35 e 42 do experimento. Após a coleta, as amostras serão centrifugadas e o soro coletado e armazenado a – 20 °C até o momento de realização das análises.
Avaliação da resposta imune humoral
Os testes de ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto serão realizados segundo Dummer et al. (2014) com modificações. A rgD de BoHV-5 e um cultivo inativado de BoHV-5 serão utilizados para a sensibilização das placas. Os soros dos animais serão testados para IgG total, IgG1, IgG2a e IgG2b. Serão utilizados os anticorpos monoclonais IgG anti-mouse conjugado a peroxidase (Sigma-Aldrich), IgG1, IgG2a e IgG2b anti-mouse (Sigma-Aldrich). Para visualizar a reação será utilizado tampão para substrato, Ortho-Phenylenediamine – OPD (Sigma-Aldrich) e H2O2 deixando reagir por 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Para interromper a reação será adicionado H2SO4 2N. As absorbâncias serão medidas em leitor de microplacas EZ Read 400 (Biochrom, UK) com filtro de 492 nm.
Avaliação da resposta imune celular
Os camundongos de todos os grupos experimentais serão eutanasiados no dia 42 do experimento, o baço será coletado e macerado. As células do baço (2x106) serão cultivadas em meio RPMI-1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), antibiótico e antifúngico (Penicilina 10.000 UI/mL, Estreptomicina 10 mg/mL e Anfotericina B 25 mg/mL) em placas de cultivo celular com 24 poços. As células serão incubadas a 37 °C com 5% CO2 durante 24 horas e serão adicionados os seguintes estímulos: 10DI de BoHV-5, 2 μg de rgD, 2,5 μg de Concanavalina (ConA) (Sigma-Aldrich) e meio RPMI 1640 sozinho, após serão novamente incubadas durante aproximadamente 18 horas nas mesmas condições. Os estímulos com ConA e RPMI 1640 serão utilizados como controle para o estímulo das células. Ao final, o sobrenadante será coletado e armazenado a -20 °C até o momento da realização das análises de quantificação de expressão relativa de mRNA de citocinas por RT-qPCR. As células serão coletadas em TRIzol® reagente (Life Technologies, Carlsbad, California, USA).
A extração do RNA das PBMCs será realizada pelo método de TRIzol disponibilizado pelo fabricante. O cDNA será sintetizado utilizando aproximadamente 200 ng de RNA. A reação será realizada conforme as instruções do kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) será realizada no Stratagene M×3005P real time PCR system (Agilent Technologies) segundo De Avila et al. (2016). GAPDH ou B-actina serão utilizados como genes endógenos de referência. Todas as amostras serão analisadas em triplicata. A partir dos valores de Threshold Cycle (Ct) obtidos será calculada a expressão relativa dos genes, de acordo com o método 2-ΔΔCT descrito por Livak & Schmittgen (2001). Os oligômeros iniciadores específicos IL-4, IL-10, IL-12B, IFN-ˠ e GAPDH foram descritos anteriormente (PUECH et al., 2015).

Indicadores, Metas e Resultados

Adsorver a rgD de BoHV-5 e o vírus BoHV-5 inativado aos esporos de Bacillus spp. nos esporos.
• Vacinar os camundongos com a rgD de BoHV-5 e com o vírus BoHV-5 inativado adsorvidos à capa de esporos de Bacillus spp.
• Estudar a modulação da resposta imune humoral e celular mediada pelas vacinas contendo rgD e o BoHV-5 adsorvidos aos esporos de Bacillus spp.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
JÉFERSON VIDART RAMOS
MAYARA CAETANO ABREU
NEIDA LUCIA CONRAD

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 600,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 600,00

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