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O Coronavírus 2 Associado à Síndrome Respiratória Aguda Severa (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2) está causando, desde 2019, uma pandemia mundial de grandes proporções. Devido a gravidade da doença, que causou dentre outras adversidades, o colapso do sistema de saúde e grandes perdas econômicas, os esforços do mundo inteiro se voltaram para desenvolvimento de métodos diagnósticos, tratamentos e vacina para a doença causada em decorrência da infecção, a COVID-19. Com isso, em tempo recorde, em torno de 10 meses a 1 ano e meio (CREECH; WALKER; SAMUELS, 2021; KRAMMER, 2020) diferentes vacinas foram desenvolvidas para COVID-19. Apesar de terem sido desenvolvidas devido ao conhecimento obtido com o desenvolvimento inicial de vacinas para SARS-CoV e MERS-CoV (KRAMMER, 2020), tal fato gerou desconfiança por parte da população. Com isso, correntes ideológicas antivacinas se aproveitaram da situação para disseminar notícias falsas, ou seja, notícias sem qualquer respaldo científico, a respeito de tais vacinas. Dentre as notícias falsas propagadas sobre as vacinas contra a COVID-19 destaca-se a de que “vacinas contra a COVID-19 causam impotência e/ou esterilidade” (BRASIL, 2021a; Veja, 2021). Assim, para buscar refutar ou confirmar tal hipótese, o modelo zebrafish pode exercer papel chave, visto que é um modelo amplamente empregado em estudos translacionais. Com isso, o projeto proposto visa avaliar os efeitos da injeção de uma solução contendo proteínas N recombinantes (do nucleocapsídeo), de SARS-CoV-2 sobre os miRNAs dos espermatozoides de zebrafish. Esses resultados têm potencial de gerar um conjunto de biomarcadores moleculares epigenéticos para o déficit reprodutivo, podendo ser uma ferramenta bastante útil no processo de testagem de futuras vacinas para a COVID-19. Além disso, os resultados gerados poderão ser usados para conscientizar a população sobre o nível de segurança de vacinas no que se refere ao sistema reprodutor masculino.

Animais e condições
Zebrafish serão obtidos em ambiente de biotério. Desde a eclosão até o estágio adulto, os animais serão alimentados 2 vezes ao dia até a saciedade. O regime de fotoperíodo será ajustado para 14 h claro/10 h escuro. Durante a aclimatação e período experimental os animais serão mantidos em água com temperatura entre 26 e 28 °C, pH entre 7 e 8, oxigênio dissolvido a cerca de 6 mg.L-1 e amônia e nitritos o mais próximo de zero possível. Os zebrafish serão mantidos em sistema estático em aquários plásticos com volume total de 56 L no Biotério de Biomodelos Aquáticos da UFPEL.
Desenho experimental e coleta das amostras
O desenho experimental é composto por 2 grupos experimentais: animais que serão inoculados com a proteína N recombinante (recN) de SARS-CoV-2, e animais que serão inoculados apenas com solução tampão. Cada grupo contará com 3 aquários e cada aquário abrigará um total de 27 zebrafish, totalizando um n amostral de 81 animais por grupo.
Após a inoculação nos animais, eles serão mantidos vivos até cada um dos 3 pontos de finalização para amostragem: 24 horas, 7 dias e 3 meses. Chegado cada ponto temporal, os animais serão capturados com utilização de um puçá e transferidos para um aquário contendo solução de tricaína (MS-222 a 650 mg.L-1), objetivando a eutanásia dos animais. Medições biométricas serão realizadas.
A cauda dos animais será incisada para coleta de 10 µL de sangue com ajuda de uma micropipeta. O sangue coletado será adicionado a 1 mL de soro fetal bovino (SFB) e será armazenado a 4 °C no escuro por aproximadamente 30 minutos até seu uso nas análises de citometria de fluxo. Em seguida os animais serão necropsiados para extração e pesagem dos testículos, que serão destinados às diferentes análises propostas. Além disso, o fígado também será coletado para pesagem e cálculo dos índices hepatossomáticos.
Os testículos destinados à biologia molecular serão acondicionados em criotubos e armazenados em nitrogênio líquido (N2) até o processamento. Os testículos destinados à análise de cinética espermática (por CASA) serão acondicionados em microtubos e adicionados a 100 µL de Beltsville Thawing Solution (BTS) à temperatura ambiente até o uso (aproximadamente 30 min. de espera). Os testículos destinados às análises de histologia serão acondicionados em microtubos contendo 1mL de solução de Bouin, que deverá ser substituída após 6 h por álcool 70% e ser armazenada até seu uso.
No tempo de 24 h e 7 dias pós-injeção, 9 animais de cada aquário serão eutanasiados: 5 para formar um pool e destinado ao sequenciamento de miRNAs; 2 para análises de CASA; e 2 que fornecerão os testículos esquerdos para análises de citometria de fluxo e os testículos direitos para histologia No tempo amostral de 3 meses haverá apenas o diferencial de que serão usados apenas 2 animais para análise de expressão de miRNAs por qPCR.

Clonagem, expressão e purificação da proteína N recombinante de SARS-CoV-2
A sequência nucleotídica que codifica uma porção da proteína nucleocapsídeo de SARS-CoV-2 será amplificado através da técnica de PCR convencional. O produto da PCR será purificado seguido de digestão e inserção no vetor de expressão pET-28a.
A recN será expressa em Escherichia coli HST08 cepa Stellar quimiocompetente. O produto eluído de recN será concentrado e as proteínas recN serão analisadas por SDS-PAGE 15% quanto à pureza, seguido da confirmação por Western Blot.

Inoculação de proteína recombinante
Será realizada 1 inoculação intracelomática por animal de uma solução contendo 1 μg de recN purificado diluído em 10 μL de tampão de inoculação. Um grupo de animais controle receberá a inoculação contendo apenas o tampão de diluição. A recN será inoculada em 81 machos da espécie zebrafish (previamente anestesiados com MS-222 (Sigma, EUA) na concentração de 150 mg.L-1) no dia zero do período experimental.

Avaliação dos índices gonadossomático e hepatossomático
Após a eutanásia e durante a necropsia de cada animal, os testículos e o fígado serão pesados para cálculo dos índices godadossomático e hepatossomático, respectivamente. Os índices serão avaliados seguindo as fórmulas:
índice gonadossomático=(peso dos testículos/peso corporal total)×100;
índice hepatossomático=(peso do fígado/peso corporal total)×100.

Análise histológica
Após a fixação em solução de Bouin, as amostras serão emblocadas em parafina, seccionadas através de micrótomo e coradas por hematoxilina e eosina. As lâminas serão avaliadas através de microscopia óptica.

Análise da motilidade e cinética espermática
As amostras serão avaliadas pelo sistema CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis), acoplado ao microscópio óptico, e observadas com aumento de 200×. Os espermatozoides serão ativados com solução de ativação, constituída de solução de bicarbonato de sódio e aplicados em lâmina coberta com lamínula. As variáveis avaliadas pelo CASA serão: Motilidade total, Motilidade progressiva, Percurso médio da velocidade (VAP), Linha curva da velocidade (VCL), Linha reta da velocidade (VSL) e Linearidade (LIN). Para cada amostra, pelo menos 500 espermatozoides serão contados ao longo de 10 campos de observação capturados.
O período de motilidade espermática será avaliado utilizando 2 µL de sêmen misturados com 10 µL de solução de ativação e carregadas em lâminas cobertas com lamínula. Um cronômetro será disparado e a duração da motilidade espermática será registrada até que as células espermáticas parem de se mover.

Produção de EROs, peroxidação lipídica, fluidez de membrana e dano ao DNA genômico em células sanguíneas e espermáticas
As análises de citometria de fluxo serão realizadas utilizando o sistema Attune® Acoustic Focusing Flow Cytometer. Serão avaliados parâmetros de peroxidação lipídica, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), fluidez de membrana e fragmentação do DNA genômico tanto nos eritrócitos quanto nos espermatozoides de zebrafish dos grupos controle e inoculado com proteína recN.

Extração de RNA total a partir dos espermatozoides
O RNA total será isolado a partir dos espermatozoides maduros provenientes dos testículos dos indivíduos dos grupos controle e inoculado com recN, usando um método combinado de TRIzol Reagent e colunas RNeasy mini spin. Resumidamente, as amostras de testículos serão colocadas em 1 mL de solução de lise contendo Triton a 0,5% e SDS a 0,1% em temperatura ambiente por 30 min. para a remoção das células somáticas contaminantes.
As amostras extraídas serão tratadas com DNase para remoção de ácidos nucleicos contaminantes, previamente às análises de concentração e pureza do RNA no sistema Agilent 4200 TapeStation. Todas as amostras de RNA serão armazenadas a -80 °C até serem utilizadas para os ensaios de sequenciamento de miRNAs e análise da expressão diferencial de miRNAs por qPCR.

Sequenciamento de miRNAs espermáticos
As bibliotecas de miRNAs serão preparadas a partir de pools de amostras de RNA extraídas com o kit NEBNext® Small RNA Library Prep. A amplificação das bibliotecas será realizada com 15 ciclos usando 100 ng de RNA total como template inicial. Posterior à amplificação por PCR, as bibliotecas serão corridas em um gel de poliacrilamida a 6% durante 60 min a 120 V, sendo as bandas de ~140 pb excisadas do gel e quantificadas através do equipamento BioAnalyzer 2100.
As doze bibliotecas de miRNAs serão analisadas e agrupadas em concentrações equimolares antes do sequenciamento na plataforma Illumina NovaSeq 6000 utilizando as configurações para leituras de 50 pb do tipo single-end. O preparo das bibliotecas e o sequenciamento dos miRNAs serão conduzidos por serviço especializado.

Identificação dos miRNAs, análise de expressão diferencial e predição in silico dos genes alvos e vias moleculares afetadas
Os dados brutos gerados a partir do sequenciamento dos miRNAs serão submetidos a um processo de limpeza para remoção de primers, adaptadores do tipo N e poliA, sequência sem index ou menores que 17 nucleotídeos.
O alinhamento das sequências será realizado no webserver RNA Toolbox. Já a expressão diferencial dos miRNAs entre os dois grupos experimentais será feita com o pacote edgeR. Os miRNAs que apresentarem valores para o critério de FDR (False Discovery rate)>0,05 e alteração na expressão (Fold Change)>2,0 serão considerados como supra-expressos, enquanto aqueles miRNAs com FDR<0,05 e FC<0,50 considerados como infra-expressos.
A ferramenta mirPath versão 3.0 será usada para identificar os genes regulados pelos miRNAs expressos diferencialmente, usando o banco de dados microT-CDS versão 5.0. Os termos da ontologia genética (GO terms) dos genes alvos destaques serão identificados e agrupados usando a mesma ferramenta mirPath.

Validação da expressão diferencial de miRNAs por qPCR
Serão realizados ensaios de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) no sistema CFX96 Real-Time PCR. Os miRNAs maduros contidos nas amostras de RNA total extraídas serão transcritos reversamente por primers do tipo stem-loop, sendo os produtos de transcrição reversa amplificados usando um primer reverso universal e um primer direto específico de cada miRNA e misturados aos reagentes de detecção do kit GoTaq qPCR. Todas as amostras serão analisadas em triplicatas, sendo que a razão de expressão relativa será calculada usando o método 2−ΔΔCt, tendo como normalizador os genes U6 e let-7d.

Análise estatística
A normalidade dos dados gerados será avaliada através do teste de Shapiro-Wilk. A homogeneidade de variâncias será testada através dos testes de Levene; O’Brien e Brown & Forsythe. A diferença estatística entre os valores médios dos grupos experimentais será pesquisada através de teste T de Student ou teste de Wilcoxon, com níveis de significância de 95%. O software estatístico utilizado será o Statistix v.10.0.

- Diferenciar em nível celular e molecular os presumíveis efeitos causados pela inoculação ou não de proteína N recombinante de SARS-CoV-2 sobre o sistema reprodutor masculino de zebrafish.
- Identificar um conjunto de biomarcadores epigenéticos para o déficit reprodutivo em decorrência da inoculação de proteína N de SARS-CoV-2 em zebrafish.
- Desenvolver e patentear uma ferramenta biotecnológica baseada em biomarcadores epigenéticos miRNAs para diagnóstico molecular do déficit reprodutivo de zebrafish inoculados com proteína N recombinante de SARS-CoV-2, a qual poderá vir a ser utilizada, por exemplo, durante o processo de testagem de futuros imunizantes para COVID-19.
- Publicar os dados em revistas científicas com alto fator de impacto após realização do pedido de proteção da tecnologia ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial.