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O câncer colorretal (CCR) representa aproximadamente 10% da incidência global de câncer, sendo considerado a terceira causa mais comum de câncer em homens e mulheres no mundo e a segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos. A American Cancer Society havia estimado cerca de 104.270 novos casos de câncer de cólon, 45.230 novos casos de câncer retal e a causa de 52.980 mortes nos Estados Unidos para o ano de 2021. Apesar da sobrevivência dos pacientes com CCR ter aumentado significativamente durante a última década devido ao diagnóstico precoce e aos avanços na quimioterapia, cirurgia e radioterapia, novos desafios surgiram, principalmente aqueles relacionados aos problemas de saúde mental. A depressão maior (DM) é um dos transtornos mentais mais frequentemente relacionado ao CCR. Evidências apontam que a prevalência de DM em pacientes com CCR varia de 13% a 57% devido ao diagnóstico vir acompanhado por diversos fatores que sobrecarregam emocionalmente e psicologicamente os pacientes, como por exemplo a longa duração do tratamento, efeitos adversos da quimioterapia, a colostomia, interrupção na vida social por um longo período e diminuição da qualidade de vida [5,2]. Um estudo mostrou que 69,4% dos pacientes com CCR desenvolveram DM, e interessante este estudo não encontrou diferença estatística entre DM e gênero, bem como entre DM e idade. Cabe ressaltar que a DM é um transtorno que limita gravemente o funcionamento psicossocial e diminui drasticamente a qualidade de vida, sendo responsável por cerca de 60% dos 800.000 de casos de suicídio ao ano no mundo [7]. Consequentemente, estratégias terapêuticas que sejam capazes de reduzir o impacto da DM em pacientes com CCR parecem ser de extrema importância. A relação entre essas patologias não engloba apenas dados estatísticos e epidemiológicos, visto que muitas alterações bioquímicas e morfológicas produzidas por esses quadros clínicos se sobrepõem. Vários fatores estão associados à incidência tanto do CCR quanto da DM, como dieta e estilos de vida não saudáveis, distúrbios metabólicos, fatores ambientais e genéticos, e interessantemente, estes mesmos fatores também determinam a composição da microbiota intestinal. Nos últimos anos a microbiota intestinal emergiu como um ator crítico na manutenção da saúde humana, influenciando não apenas o trato gastrintestinal, mas também outros órgãos, como o cérebro. Assim, a disbiose, ou seja, alterações na composição e nas funções da microbiota intestinal, contribui para o desenvolvimento de diversas patologias, incluindo o CCR e a DM. O cólon apresenta a maior densidade bacteriana do trato gastrintestinal, o que pode apontar o papel importante da microbiota no CCR. De fato, estudos em humanos e animais que relacionaram a microbiota intestinal com CCR, identificaram algumas espécies bacterianas específicas que promovem a tumorigênese, incluindo a Escherichia coli, Bacteroides fragilis enterotoxigênica e Fusobacterium nucleatum. É importante mencionar que embora as E. coli sejam comensais intestinais, algumas cepas têm a capacidade de promover inflamação e de produzir toxinas, como a colibactina. A colibactina é uma molécula de interesse na carcinogênese colorretal, uma vez que estudos demonstraram que E. coli que expressam a colibactina tem a capacidade de potencializar a tumorigênese intestinal em camundongos. Outro fator importante é que a Bacteroides fragilis enterotoxigênica induz altos níveis de espécies reativas de oxigênio, que danificam o DNA do hospedeiro, podendo ultrapassar os mecanismos de reparo, levando a mutações, o também medeia o dano ao DNA e promove a proliferação de células tumorais através da via Wnt / β-catenina, o que também contribui para a tumorigênese intestinal. Desta maneira, a relação entre a microbiota intestinal e o CCR é multifatorial e bidirecional, uma vez que alterações na composição desta comunidade microbiana associadas ao câncer podem ocorrer como resultado da doença, mas também podem contribuir para a sua progressão. Altos níveis de espécies reativas no intestino também causam danos aos lipídios e proteínas e disfunção mitocondrial, causando eventos importantes, como carbonilação de proteínas celulares que levam ao aumento da permeabilidade da barreira intestinal e a inflamação. O aumento da permeabilidade da barreira intestinal permite que componentes metabólicos bacterianos se translouquem do lúmen intestinal e se difundem sistemicamente, podendo se disseminar para locais distantes, e até mesmo passar a barreira hematoencefálica e atingir o cérebro, desencadeando a neuroinflamação. Por outro lado, a ativação do sistema imunológico periférico também pode levar ao aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, as quais serão transportadas para o sistema nervoso central (SNC), onde irão estimular as células microgliais a produzirem citocinas pró-inflamatórias, por um
mecanismo de feedback, acentuando a neuroinflamação. Nessas condições ocorre o desenvolvimento de DM em pacientes suscetíveis. As citocinas pró-inflamatórias também podem estimular o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) a liberar glicocorticóides que suprimem a neurogênese, outras características encontradas na fisiopatologia da DM. Além do mais, um crescente corpo de pesquisas também descreve a comunicação bidirecional entre a microbiota intestinal com o SNC do hospedeiro. Acredita-se que essa via de sinalização bioquímica, também conhecida como eixo microbiota-intestino-cérebro, influencie o comportamento e humor por meio de interação envolvendo mecanismos de sinalização nervosos, endócrinos e imunológicos, pois muitas espécies bacterianas regulam a produção de neurotransmissores e seus precursores, metabólitos e compostos neuroativos que estão intimamente relacionados com a função cerebral, como por exemplo a serotonina, o triptofano e os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), além de serem capazes de modificar os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Por tanto, um desequilíbrio no eixo microbiota-intestino-cérebro, tem sido usado como hipótese para interpretar a patogênese da DM [28,14]. Os mecanismos pelos quais esse desequilíbrio pode estar relacionado a DM envolve a microbiota intestinal, o SNC, o sistema nervoso entérico (ENS), o eixo HPA, o sistema imunológico, vários neurotransmissores e reguladores neurais, a barreira intestinal e a barreira hematoencefálica. Desta maneira, evidências cumulativas sugerem que modificar a composição da microbiota intestinal de maneira benéfica, por exemplo, fazendo o uso de probióticos, pode ser uma viável opção de tratamento para indivíduos com CCR e que sofrem de DM. Vários estudos in vitro, pré-clínicos e clínicos têm mostrado resultados promissores em relação às propriedades anticarcinogênicas e antidepressiva dos probióticos [14,29,31-40]. Um corpo crescente de evidências demostra os principais mecanismos responsáveis por essas propriedades, como podemos citar: (I) modificação da composição da microbiota intestinal; (II) imunomodulação; (III) produção de metabólitos (IV) manutenção da integridade da barreira intestinal; (V) manutenção da integridade da barreira hematoencefálica; (VI) inibição da proliferação celular e apoptose de indução em células cancerosas; (VII) sinalização redox e (VIII) neurogênese e neuroplasticidade. Diante disso, o nosso grupo de pesquisa hipotetizou que a utilização de uma nova levedura com atividade probiótica, a Komagataella pastoris KM71H, pode possuir efeito anticarcinogênico e ser capaz de melhorar os sintomas depressivos. A Komagataella pastoris é uma levedura encontrada em árvores e é amplamente utilizada como vetor para a expressão de proteínas heterólogas em todo o mundo, porém informações sobre sua utilização para outros fins eram escassas. Por tanto, o Laboratório de Imunologia Aplicada, localizado no departamento de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas e parceiro ao nosso grupo de pesquisa, foi responsável pela caracterização da atividade probiótica desta levedura. Um estudo demonstrou as propriedades probióticas da Komagataella pastoris, linhagem X-33, enfatizando a ação antibacteriana contra Salmonella Typhimurium. Os resultados encontrados foram promissores, onde a levedura permaneceu
viável e persistiu em concentração adequada na dieta por pelo menos dois meses, sobreviveu às tensões do trato gastrintestinal in vitro e in vivo e não causou alterações comportamentais ou lesões quando administrada em camundongos. Assim, demostrou-se que a Komagataella pastoris possui propriedades probióticas com notável atividade antibacteriana contra Salmonella Typhimurium. Além disso, o Laboratório de Imunologia Aplicada também validou a Komagatella pastoris, cultivada em um efluente da indústria de arroz parboilizado suplementado com um subproduto da indústria de biodiesel, como probiótico para frangos de corte em termos de segurança, efeito na eficiência alimentar e imunomodulação. Esses trabalhos demonstram o potencial promissor da Komagataella pastoris em ser utilizada como um probiótico, e nos impulsionaram a investigar outros possíveis mecanismos probióticos proporcionados por esta levedura. Um estudo desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa demonstrou, pela primeira vez, o seu efeito do tipo antidepressivo em modelos animais de depressão. Os resultados encontrados foram interessantemente promissores, onde foi apontado os benefícios da administração de Komagataella pastoris KM71H na atenuação das mudanças comportamentais, neuroquímicas e neuroendócrinas em modelos animais de comportamento tipo depressivo induzido por estresse de contenção repetido e lipopolissacarídeo. Desta maneira, frente aos resultados da Komagataella pastoris com propriedades promissoras de um probiótico com efeito do tipo antidepressivo, o objetivo deste projeto é avaliar os efeitos do tratamento com desta levedura na díade entre CCR
e DM em um modelo animal de CCR induzido por azoximetano e sulfato de sódio de dextran.

Delineamento experimental
Para avaliar o efeito do tipo antidepressivo e a melhora da progressão do tumor através do tratamento com a Komagataella pastoris KM71H em um modelo animal de câncer colorretal, os camundongos Balb/c fêmas serão primeiramente divididos em 4 grupos experimentais (n = 12):
G1: Salina + PBS
G2: Salina + Komagataella pastoris KM71H
G3: AOM/DSS + PBS
G4: AOM/DSS + Komagataella pastoris KM71H
Nos grupos 1 e 3 será administrado pela via intragástrica (i.g) 0,5 mL de PBS, enquanto nos grupos 2 e 4 será administrado pela via i.g. 0,5 mL (10<8 unidades formadoras de colônia) de K. pastoris KM71H diluída em PBS. A administração de PBS ou K. pastoris KM71H será iniciada duas semanas antes da realização dos testes comportamentais e da eutanásia, para melhor entendimento a linha experimental está ilustrada na figura 2. Para induzir o câncer colorretal, os grupos 3 e 4 receberão uma injeção intraperitoneal (i.p.) de azoximetano (AOM) na dose de 10 mg/kg e os grupos 1 e 2 receberão solução salina (i.p.). Após uma semana, os grupos 3 e 4 grupos receberão água contendo 2% de sulfato de dextrano de sódio (DSS) por 5 dias, seguidos de 2 semanas de recuperação, ou seja, será substituído a água com 2% de DSS
por água normal. Os camundongos receberão mais dois ciclos de água contendo 2% de DSS seguidos de 2 semanas de recuperação. O grupo 1 e 2 receberão apenas água normal durante todo o protocolo. Nos 14 dias finais do protocolo, onde os animais irão estar recebendo água normal, os grupos 2 e 4 irão receber o tratamento de K. pastoris KM71H (108 unidades formadoras de colônia/animal, i.g.), enquanto os grupos 1 e 3 irão receber PBS (0,5 mL/animal, i.g). O peso corporal dos animais será monitorado duas vezes por semana. Após 24h do final dos tratamentos, os animais serão avaliados no teste do campo aberto para verificar a atividade locomotora, após serão realizado o teste da suspensão da causa, o teste “splash” e o teste do nado forçado para avaliação da atividade do tipo antidepressiva. Após os testes comportamentais será coletado de forma espontânea as fezes dos animais e, então serão eutanasiados através da exposição ao isoflurano coleta de sangue, intestino, córtex pré-frontal e hipocampo para as análises ex vivo, bem como serão retirados o baço e os tumores para serem pesados em balança analítica.

A complementação dos resultados comportamentais ocorrerá pela investigação das vias moleculares envolvidas com a atividade da Komagataella pastoris KM71H. Após os ensaios comportamentais, será coletado de forma espontânea as fezes dos animais e após serão eutanasiados para obtenção do plasma sanguíneo, macrófagos intraperitoneais, intestino, córtex pré-frontal e hipocampo. Essas amostras serão utilizadas para a avaliação de biomarcadores de estresse oxidativo, neuroplasticidade, inflamação, neuroinflamação, apoptose, integridade da barreira intestinal, análise dos níveis de ácidos graxos de cadeia curta e para a avaliação da microbiota intestinal através de técnicas bioquímicas incluindo, RT-PCR, Western Blot, imuno-histoquímica, histologia e ELISA. Além do mais será coletado o baço e os tumores para serem pesados em uma balança analítica.

Tento em vista que o CCR é um dos cânceres mais comum em homens e mulheres em todo o mundo e que 13-57% dos pacientes acometidos por essa doença também apresentam DM maior, é extremamente justificável a crescente atenção dedicada à busca de novas estratégias terapêuticas. Em adição a isso, considerando o crescente entendimento do papel da composição da microbiota intestinal no desenvolvimento do CCR e do DM, e de que a modificação desta composição através do uso de probióticos pode ser uma alternativa de tratamento para estas patologias, se faz interessante a avaliação da inovadora proposta deste projeto, a qual busca investigar um novo microrganismo que possa modular as interações entre a microbiota intestinal e o SNC, a fim de melhorar tanto a progressão do tumor quanto minimizar os sintomas depressivo induzido pelo CCR. Diante disso, tem-se estabelecido diversos modelos animais para o estudo do CCR, os quais tem o objetivo de mimetizar as alterações patofisiológicas encontradas nos pacientes, permitindo assim o estudo de novas estratégias terapêuticas. Dentre esses, vale destacar a aplicação dos agentes químicos AOM e DSS como indutor do CCR em roedores. O modelo AOM/DSS é considerado poderoso e reproduzível, que utiliza indução química de dano ao DNA seguido por ciclos repetidos de colite, capaz de desenvolver tumores localizados distalmente e adenocarcinomas invasivos, e tem sido crucial para desvendar a patogênese do CCR a partir de vias de sinalização, como as vias inflamatórias, apoptóticas e antioxidantes e sobre a influência da microbiota intestinal. Além do mais, esse modelo pode alterar a comunicação do eixo microbiota-intestino-cérebro, o qual tem recebido crescente atenção no ramo da neurociência, uma vez que a composição da microbiota intestinal é um fator determinante para a progressão do DM e do CCR, ao mesmo tempo em que está envolvida com a eficácia de novos tratamentos para essas patologias. Nesse sentido, o presente projeto busca caracterizar o uso da Komagataella pastoris KM71H, uma levedura com atividade probiótica, para o tratamento de pacientes com CCR e depressão. Espera-se que o tratamento com essa levedura seja capaz de inibir a progressão do tumor e de atenuar o comportamento depressivo induzido pelo CCR. Em adição, especulamos identificar quais os mecanismos moleculares responsáveis pelos efeitos da Komagataella pastoris KM71H na comorbidade entre CCR e o DM. Com isso, busca-se apresentar uma estratégia terapêutica mais segura e que seja capaz em modular as principais vias de sinalização responsáveis pelas alterações encontradas no CCR, e dessa forma prevenir o comportamento depressivo que surge principalmente como consequência da desregulação do eixo microbiota-intestino-cérebro e do sistema imune.
Nos últimos anos, as pesquisas envolvendo o eixo microbiota-intestino-cérebro tem surgido para ampliar fronteiras do conhecimento nos campos da neurociência, microbiologia e nutrição e trazer novas e promissoras estratégias terapêuticas para o tratamento de diversas doenças. Central a essa pesquisa estão os probióticos, que quando ingeridos, influenciam várias rotas bioquímicas para melhorar o funcionamento geral do organismo do hospedeiro. Muitos estudos propuseram mecanismos potenciais pelos quais os probióticos parecem inibir o desenvolvimento do CCR, incluindo a modificação da composição da microbiota intestinal, alterações na atividade metabólica da microbiota, produção de compostos com atividade anticarcinogênica e antioxidante, imunomodulação, melhora da barreira intestinal, alterações na fisiologia do hospedeiro, inibição da proliferação celular e indução de apoptose em células cancerosas. As propriedades dos probióticos também se tornou um poderoso ator nas pesquisas psiquiátricas, extensos estudos sugerem sua contribuição na manutenção do equilíbrio psico-neuro-imunológico por meio de várias ações, como a modulação dos sistemas imunológico e neuroendócrino, regulação da neurogênese e através da produção de diversos compostos neurotativos, como os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e neurotransmissores. Esses efeitos benéficos de probióticos para o CCR e a depressão nos impulsiona a caracterizar a atividade de uma nova levedura com atividade probiótica em um modelo da díade entre CCR e depressão. Com os resultados obtidos da presente proposta, buscamos contribuir com a comunidade científica aumentando o conhecimento disponível sobre a Komagataella pastoris, a qual foi caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa em parceria com outros grupos de pesquisas na Universidade Federal de Pelotas. Além disso, temos como objetivo fundamental apresentar uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da díade entre CCR e depressão, uma vez que as estratégias terapêuticas convencionais para ambas as patologias apresentam inúmeros efeitos adversos, visando assim melhorar a qualidade de vida dos pacientes. O desenvolvimento desse projeto também terá como resultado a integração multidisciplinar de diferentes áreas e grupos de pesquisa dentro e fora da Universidade Federal de Pelotas, o que sem dúvida será essencial para o desenvolvimento de trabalhos de qualidade e com grande impacto social e científico. Além do mais, este projeto é inovador e de alto impacto tecnológico pois contribuirá com o fortalecimento da ciência frente às recentes descobertas que acercam a modulação da via microbiota-intestino-cérebro, contribuindo com a clarificação dos mecanismos exercidos pelos probióticos em diversas doenças, como o CCR e suas comorbidades, principalmente aquelas que afetam o SNC, e ainda sugerir uma nova abordagem probiótica: a Komagataella pastoris.