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Clostridioses são um grupo de infecções e intoxicações causadas por bactérias do gênero Clostridium, bacilos gram positivos, formadores de endósporos e majoritariamente anaeróbios, com algumas espécies capazes de tolerar baixas concentrações de oxigênio (Hatheway, 1990; Lobato et al., 2013), encontradas no solo e trato gastrointestinal de animais e humanos. As clostridioses são divididas em quatro categorias, conforme os sinais clínicos observados e órgãos afetados: neurotrópicas (Clostridium botulinum tipo C e D e Clostridium tetani), mionecrosantes (Clostridium perfringens tipo A, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium chauvoei e Clostridium septicum), entéricas/enterotoxêmicas (Clostridium perfringens tipos A-D) e hepatonecróticas (Clostridium septicum, Clostridium novyi e Clostridium haemolyticum). Os dados epidemiológicos acerca destas enfermidades no Brasil são escassos, entretanto, a estimativa é que causem a morte de aproximadamente 500.000 bovinos por ano, resultando em prejuízo de cerca de R$ 1 bilhão de reais (Dutra, 2016).
Essas doenças apresentam curso extremamente rápido e letal, tornando as medidas terapêuticas ineficazes. Portanto, a forma mais eficiente de proteção contra tais enfermidades é a vacinação com bacterinas/toxoides polivalentes (bactérias e toxinas inativadas) que induzem a produção de anticorpos neutralizantes. Atualmente, todas as vacinas veterinárias comerciais contra clostridioses são formulações polivalentes eficientes, compostas de bactérias e toxinas oriundas de diferentes espécies clostridiais. Contudo, apresentam algumas limitações, destacando: i- a produção industrial requer vários bioprocessos (10) e uma etapa de inativação antigênica morosa; ii- Clostridium spp. produz níveis pouco previsíveis de toxinas in vitro; iii- variações de potência imunogênica entre lotes de vacinas; iv- requer a manipulação de cepas patogênicas cujas potentes toxinas afetam o homem; v- indução de imunidade de curta duração.
Na última década, buscando contornar essas limitações que são comuns à toda indústria de imunizantes clostridiais, nosso grupo de pesquisa vem se destacando no desenvolvimento de vacinas recombinantes inovadoras contra clostridioses (Milach et al., 2012; Gil et al., 2013; Salvarani et al., 2013; Cunha et al., 2014; Moreira et al., 2014; Moreira GM et al., 2016; Moreira et al., 2016; Ferreira et al., 2016; Otaka et al., 2017; Moreira et al., 2018; Ferreira et al., 2018; Ferreira et al., 2019, Moreira et al., 2020; Otaka et al., 2020; Alves et al., 2021; Freitas et al., 2021; Galvão et al. 2021; Rodrigues et al. 2021; Santos et al., 2021; Alves et al., 2022; Moreira et al., 2022). Entretanto, apesar destas pesquisas contribuírem para o avanço significativo da área científica e resultar em tecnologias que foram absorvidas pela indústria alvo, os bioprocessos individuais para compor a formulação polivalente recombinante ainda são necessários.
Diante do exposto, considerando a necessidade de reduzir o número de bioprocessos na indústria e empregando ferramentas de imunoinformática e engenharia genética, a presente proposta visa a construção de clones recombinantes multiantigênicos de Escherichia coli, simplificando o processo de produção industrial (redução do número de bioprocessos) e incrementando a imunogenicidade das vacinas.

Construção das moléculas multiantigênicas
A partir de análises de imunoinformática na pipeline desenvolvida pela Helper Imunobiológicos Ltda., domínios e regiões imunogênicas de cada antígeno serão selecionados para a construção de moléculas multiantigênicas. Genes sintéticos serão sintetizados pela Epoch Biolabs, Inc. (USA), contendo códons preferenciais de E. coli (codon usage) e sítios de enzimas de restrição para clonagem no vetor de expressão multiantigênico desenvolvido pela Helper Imunobiológicos.

Expressão e purificação dos antígenos recombinantes
Escherichia coli BL21 (DE3) competente será transformada com o vetor recombinante mediante eletroporação. Um clone de cada construção será cultivado em caldo Luria-Bertani suplementado com 100 g/mL de canamicina até a fase log de crescimento (DO600=0,6-0,8) em agitador orbital (37C, 250 rpm). A expressão do antígeno recombinante será induzida por 3 h com 0,5 mM de IPTG, seguido de confirmação através de SDS-PAGE e Western blot (WB) com MAb anti-cauda de histidina (Invitrogen). Pellet da cultura será obtido por centrifugação a 6.000 × g por 10 minutos, a 4 ºC, e ressuspendido em tampão de lise (NaH2PO4 0,2 M, NaCl 0,5 M, Imidazol 0,005 M). Esta solução, depois de sonicada, será centrifugada a 10.000 × g por 30 minutos a 4 ºC. O sobrenadante, após filtração com membrana 0,8 m, será submetido à purificação por cromatografia de afinidade em uma coluna de Ni-Sepharose utilizando o sistema de cromatografia ÄKTAprime (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), segundo instruções do fabricante. As soluções eluídas com tampão contendo imidazol serão dialisadas durante a noite em PBS pH 7,4, concentradas com PEG e quantificadas com o kit BCATM Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA), segundo instruções do fabricante. A pureza do antígeno recombinante será avaliada por SDS-PAGE e a sua concentração pelo método BCA (Pierce).

Caracterização dos antígenos recombinantes
A antigenicidade das moléculas será avaliada por WB utilizando MAb anti-cauda de histidina (Invitrogen), antitoxinas padrões monoespecíficas de Clostridium spp. (NIBSC, UK) e soros de bovinos e ovinos pertencentes a soroteca do Laboratório de Imunologia Aplicada da UFPel, previamente imunizados com antígenos recombinantes ou vacinas comerciais.

Elaboração da vacina
Os antígenos recombinantes serão adsorvidos em 15% (v/v) de hidróxido de alumínio. A esterilidade e inocuidade das bacterinas recombinantes serão avaliadas como recomendado pela instrução normativa no. 49 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 1997). A inocuidade será avaliada pela inoculação do dobro da dose vacinal por via intraperitoneal em camundongos. Os animais serão observados por 72 h quanto ao surgimento sinais clínicos de intoxicação ou óbito (Moreira et al. 2016; Ferreira et al. 2018; Moreira Jr. et al. 2018).

Avaliação da inocuidade e imunogenicidade das vacinas
A imunogenicidade das vacinas será avaliada em camundongos Swiss fêmeas, provenientes do Biotério Central da UFPel, com 6 a 8 semanas de idade e peso variando entre 15-20 g. Duas doses das vacinas, com intervalo de 21 dias, serão administradas por via subcutânea. Os animais serão mantidos em gaiolas apropriadas sob temperatura média de 22 ºC e ciclo de luz de 12 h e serão alimentados com ração PET específica para roedores e água ad libitum. No dia 35 após a primeira dose, realizar-se-ão coletas de sangue através de punção cardíaca visando à obtenção dos soros, que serão acondicionados a -20°C. Os camundongos serão anestesiados e eutanasiados de acordo com as normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). A resposta imune humoral será avaliada mediante ELISA indireto e WB (Ferreira et al., 2018). Os títulos de anticorpos neutralizantes serão mensurados através da técnica de soroneutralização conforme preconizado pelas normativas do MAPA ou literatura pertinente. Resumidamente, toxinas de Clostridium spp. serão incubadas durante 1 h a 37°C com os soros diluídos serialmente. Após a incubação, esta mistura será inoculada em camundongos Swiss por via intraperitoneal e as mortes observadas até 72 h. Soros dos grupos inoculados com PBS e vacina comercial serão utilizados como controle negativo e positivo, respectivamente.

Aspectos éticos
A presente proposta foi apreciada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPel em 11 de junho de 2021, recebendo parecer favorável (57/2021).

- Simplificar o processo de produção de vacinas contra clostridioses;
- Qualificar recursos humanos em vacinologia (4 bolsistas IC, um mestre e um doutor);
- Publicar pelo menos 2 artigos científicos em periódicos internacionais de excelência;
- Depositar dois pedidos de patente no INPI;
- Licenciar a tecnologia para a startup Helper Imunobiológico;
- Transferir a tecnologia para a indústria veterinária.