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As desordens mentais comuns, como ansiedade e depressão, têm alta prevalência na população, havendo um significativo aumento no atual cenário de pandemia. A ansiedade é tida como um estado de angústia e inquietação na iminência de um perigo incerto e este comportamento é inerente ao ser humano, porém quando a ansiedade se torna generalizada, ela pode ser debilitante e ser considerada patológica (Hur et al., 2020). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-V, do inglês Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) para ser considerada ansiedade generalizada devem ser incluídos critérios como ansiedade e preocupação excessivas de difícil controle, inquietação, dificuldade em concentrar-se, tensão muscular e perturbação do sono. Visto que a farmacoterapia é, atualmente, uma das formas principalmente utilizadas para o tratamento desse transtorno, existe uma constante busca por novos compostos com atividade farmacológica. O selênio é um micronutriente essencial aos mamíferos, e evidências apontam para o seu efeito neuroprotetor. Os compostos orgânicos contendo selênio em sua estrutura são interessantes do ponto de vista científico, pois possuem uma vasta aplicabilidade em síntese orgânica bem como apresentam uma série de atividades neuromoduladoras. Diversos estudos envolvendo as ações do tipo antidepressiva e ansiolítica de compostos de selênio já foram realizados, tendo demonstrado seus efeitos em diferentes modelos experimentais. Por outro lado, o núcleo benzofurano está presente em uma grande variedade de produtos naturais e compostos com atividade farmacológica. Neste sentido, uma série de compostos organocalcogênios contendo o núcleo benzofurano foram sintetizados e suas atividades biológicas vem sendo investigadas pelo nosso grupo de pesquisa. O protótipo da classe, 2-fenil-3- (fenilselanil)benzofurano (SeBZF1), já demonstrou atividade antioxidante in vitro, efeito do tipo antidepressivo modulado pelos sistemas serotoninérgico, dopaminérgico. Dados ainda não publicados pelo nosso grupo também encontraram evidências de adicionais mecanismos de ação para este protótipo da classe de 3-organoselanil benzofuranos, como a participação de mecanismo glutamatérgico e envolvimento da via L-ARG-NO. O mesmo também tem sido testado em modelo de privação de sono. O grupo tem também trabalhado com compostos que derivam deste protótipo da classe, os quais apresentam diferentes substituintes na estrutura química, sendo um deles o grupamento -OMe. Recentemente, vem-se estudando o potencial farmacológico do composto substituído 3-((4-metoxifenil)selanil)-2-fenilbenzofurano (SeBZF3) que já demonstrou efeito do tipo antidepressivo em camundongos Swiss machos. Além disso, estudos de toxicidade foram realizados e demonstraram não haver toxicidade oral aguda nos parâmetros analisados. A nossa proposta é dar continuidade às pesquisas científicas sobre o composto 3-organoselanil substituído SeBZF3, a fim de caracterizar uma possível ação ansiolítica e mecanismo de ação, complementando assim os achados de seu potencial psicofarmacológico.

O composto SeBZF3 será sintetizado pelo Laboratório de Síntese de Derivados de Selênio e Telúrio (LabSelen) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) utilizando o método descrito anteriormente por Gay et al. (2010) e dissolvido em oléo de canola. Para os estudos, serão utilizados camundongos Swiss machos da linhagem Swiss (30-35g). Os testes utilizados para mensurar o comportamento do tipo ansioso são: Teste claro escuro (TCE), Teste de labirinto em cruz elevado (TLCE), Teste de supressão alimentar pela novidade (TSAN), o Teste do campo aberto (TCA) sempre acompanhará cada um destes testes de ansiedade para avaliação da atividade locomotora e exploratória dos animais (N= 13 animais/grupo). Abaixo segue a metodologia que será empregada para a realização dos testes:

Curvas de dose-resposta para a análise de efeito do tipo ansiolítico agudo em diferentes testes comportamentais

Para a realização dos testes comportamentais, todos os experimentos serão filmados e conduzido no mesmo horário com o intuito de minimizar os fatores interferentes na análise comportamental. O comportamento para análise de ansiedade é extremamente afetado por diferentes fatores. Por isso, destaca-se que os testes TLCE, TCE e TSAN serão conduzidos em conjuntos experimentais de animais diferentes, de modo que um teste não interfira nos achados experimentais do outro (evitando o estresse de passagem por múltiplos testes que poderia afetar o comportamento de ansiedade) e que se mantenha o tempo fixo de tratamentos entre os testes para a comparação do tamanho de efeito. Além disso, cada conjunto experimental deste projeto terá até 5 grupos de animais, e será conduzido em dois dias diferentes (metade do N em cada), respeitando o mesmo horário do dia para os procedimentos (ex. 9:00-11:00h), para evitar grande variabilidade comportamental entre as experimentações. Neste sentido, para se demonstrar resultados confiáveis e de menor variabilidade possível, salienta-se a necessidade de manter os grupos de experimentos conforme delineado neste projeto.

A) Investigação da ação tipo-ansiolítica do SeBZF3 através do teste do labirinto em cruz elevado (TLCE)

Para a avaliação dos possíveis efeitos do tipo ansiolíticos em camundongos serão administradas diferentes doses do composto SeBZF3 (5, 25 e 50 mg/kg) ou veículo (óleo de canola) pela via oral (gavagem) 30 min antes da realização do teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) (Clénet et al., 2006; Walf and Frye, 2007). Antes do TLCE, será realizado o teste do campo aberto (TCA) (Walsh and Cummins, 1976) para avaliação da atividade locomotora e exploratória. Além disso, será utilizado como controle positivo a fluoxetina (inibidor seletivo da recaptação de serotonina, 30 mg/kg, i.p.) que possui um conhecido efeito ansiolítico, para validar os achados (Bhatt et al., 2017; Dawood et al., 2019; Kim et al., 2021; Kothari et al., 2010). O tempo e as doses relativos à administração do composto foram baseados em estudos prévios do nosso grupo de pesquisa (dados ainda não publicados). No TCA será registrado o número de cruzamentos entre os quadrantes e número de levantamentos sobre as patas posteriores para a avaliação da locomoção e do comportamento exploratório, respectivamente. No TLCE serão avaliados os seguintes parâmetros relacionados à ansiedade: número de entradas nos braços abertos e nos fechados, tempo gasto nos braços abertos e nos fechados, número de mergulhos e número de vezes em que o animal avaliou o risco (espreitadas). Logo após o comportamento, os animais serão eutanasiados por overdose de isoflurano e as amostras de cérebro do grupo controle e tratados com o composto serão coletadas para dosagem da atividade da monoamina oxidase (enzima metabolizadora de monoaminas).

B) Investigação da ação tipo-ansiolítica do SeBZF3 através do teste do claro-escuro (TCE)

Uma vez que o TCE é amplamente utilizado para demonstrar a ação ansiolítica de novas drogas em roedores (Bourin and Hascoet, 2003; Hascoet et al., 2001), ele será empregado para demonstrar o potencial ansiolítico do SeBZF3. Para o TCE, os animais receberão o SeBZF3 em diferentes doses (5, 25 e 50 mg/kg, v.o.) ou veículo (óleo de canola) pela via oral (gavagem) 30 min antes da realização do teste do labirinto em cruz elevado (TLCE). Fluoxetina será usada como controle positivo. Após trinta min, os animais serãosubmetidos ao TCE, e número de entradas e o tempo gasto no lado claro serão contabilizados, bem como o número total de transições entre os compartimentos. Imediatamente antes do TCE, o TCA será empregado para fins de avaliação da locomoção dos animais.

C) Investigação da ação tipo-ansiolítica do SeBZF3 através do teste de supressão da alimentação pela novidade (TSAN)

Com o objetivo de avaliar a robustez de achados do efeito do tipo ansiolítico do composto ampliando e confirmando as evidências de sua ação terapêutica, será realizado também o teste de supressão da alimentação pela novidade (TSAN) em camundongos (Bodnoff et al., 1988; Bodnoff et al., 1989). Para esse experimento, serão administradas diferentes doses do composto SeBZF3 (5, 25 e 50 mg/kg, v.o.), veículo (óleo de canola, v.o) ou controle positivo (fluoxetina, 20 mg/kg, i.p.) 30 min antes da realização do teste. Os animais passarão por um período de restrição alimentar de 24 h anterior ao teste (Bahi et al., 2014; Camargo et al., 2019; Campos et al., 2013; Garcia-Garcia et al., 2016; Liu et al., 2020; Pazini et al., 2020; Samuels, 2011; Zhang et al., 2020). Trinta min após o tratamento os animais serão individualmente submetidos ao aparato e será cronometrado o tempo de latência para comer o pellet de ração posicionado no centro do aparato. O tempo limite do teste será de 360 s. Imediatamente após o animal começar a comer o pellet central, ou quando atingir o tempo máximo do teste, será redirecionado a uma gaiola individual contendo uma porção de ração pré pesada. A quantidade de ração consumida durante 5 min por cada animal será registrada e a latência para a alimentação.

Avaliação da possível contribuição do sistema serotoninérgico no efeito do tipo ansiolítico do SeBZF3 utilizando o TLCE

A proposta de trabalho com antagonistas de um sistema de neurotransmissão é averiguar se eles agem bloqueando uma dada ação farmacológica da substância investigada, dando indícios da interação da substância com os receptores deste sistema. Uma vez caracterizada de forma robusta a ação do tipo ansiolítica do composto em teste, apenas um teste comportamental será selecionado para o estudo de mecanismos de ação a fim de reduzir o número de animais utilizados. O envolvimento de receptores 5-HT1A na ansiedade e de drogas que agem sobre estes receptores para reduzir os sintomas de ansiedade é bem descrito na literatura. Para a investigação do envolvimento dos receptores serotoninérgicos 5-HT1A no efeito tipo-ansiolítico do SeBZF3, camundongos serão pré-tratados com WAY100635 (0,1 mg/kg, s.c., antagonista seletivo do receptor 5-HT1A) (Brüning et al., 2011; Casaril et al., 2019; Castello et al., 2018; Costall and Naylor, 1997; Savegnago et al., 2007). Após 15 min, receberão o SeBZF3 em uma dose efetiva (a ser determinada pelos experimentos citados anteriormente). Trinta min após a administração do composto SeBZF3, os animais serão submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado. O teste do campo aberto também será realizado neste protocolo, imediatamente antes do teste citado. Após 4 horas decorridas do tratamento, os animais do grupo controle e do grupo tratado apenas com composto SeBZF3 serão eutanasiados por overdose de isoflurano e o cérebro será coletado para análise da atividade da enzima monoamina oxidase, uma enzima envolvida na degradação das monoaminas.

Avaliação dos efeitos do tratamento com doses subefetivas de SeBZF3 e fluoxetina (ISRS) no TLCE

Será investigada se a interação entre doses subefetivas de fármaco (fluoxetina, um inibidor seletivo da recaptação de serotonina, ISRS) com conhecida atividade ansiolítica mediada via modulação do sistema serotoninérgico e o composto SeBZF3 produz um efeito ansiolítico significativo. Para isso, camundongos receberão a administração de doses subefetivas de fluoxetina (5 mg/kg, i.p.) e SeBZF3 (a ser determinada pelos experimentos citados anteriormente). Trinta min após o tratamento serão submetidos ao TLCE. Quatro min antes do TLCE os animais serão submetidos ao TCA. A dose subefetiva de fluoxetina e buspirona será utilizada com base nos achados da literatura (Girdhar et al., 2010; Gomes et al., 2009; Haj-Mirzaian et al., 2016; Kothari et al., 2010; Panayotis et al., 2021; Rodrigues-Filho and Takahashi, 1999).

Avaliação dos efeitos do tratamento com doses subefetivas de SeBZF3 e buspirona (agonista parcial 5-HT1A) no TLCE

Será investigada se a interação entre doses subefetivas de fármacos com conhecidas atividades ansiolíticas mediadas via modulação do sistema serotoninérgico e o composto SeBZF3 produz um efeito ansiolítico significativo: a saber buspirona (um agonista parcial dos receptores 5- HT1A) e fluoxetina (um inibidor seletivo da recaptação de serotonina, ISRS). Para isso,camundongos receberão a administração de doses subefetivas de buspirona (2 mg/kg, i.p.) e SeBZF3 (a ser determinada pelos experimentos citados anteriormente). Trinta min após o tratamento serão submetidos ao TLCE. Quatro min antes do TLCE os animais serão submetidos ao TCA. A dose subefetiva de fluoxetina e buspirona será utilizada com base nos achados da literatura (Cole and Rodgers, 1994).

Estes dados visam complementar os achados pré-clínicos psicoterapêuticos do composto SeBZF3, o qual já demonstrou ação do tipo antidepressiva em camundongos Swiss machos. Espera-se, a partir da execução deste projeto, encontrar um possível candidato para o tratamento de sintomas relacionados ao transtorno de ansiedade, podendo vir a ser uma alternativa para a comorbidade depressão/ansiedade.