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O microelemento selênio apresenta como uma de duas principais funções no organismo a atividade antioxidante que visa reduzir o estresse oxidativo e normalizar as funções celulares. Essa é uma função importante visto que a disfunção redox parece estar envolvida na fisiopatologia de distúrbios como ansiedade e depressão (KIELCZYKOWSKA et al, 2018; SAMAD et al, 2021). Desta forma, o estudo de compostos que tenham em sua estrutura o selênio mostram-se promissores como possíveis agentes terapêuticos para o tratamento de doenças que envolvam o SNC. Nosso grupo de pesquisa se dedica ao estudo de compostos lipofílicos que contém esse oligoelemento (GAL et al, 2020; RECH et al 2021) porém, a possibilidade da pesquisa com sais que contenham o selênio é bastante promissora pela questão de sua solubilidade em água e também porque os sais mostram-se promissores nos efeitos farmacológicos podendo prevenir/evitar problemas no desenvolvimento de fármacos uma vez que, algumas de suas características físicas podem ser utilizadas para alterar fatores que interferem na absorção e estabilidade do fármaco (GLANZNER E SILVA, 2010). Além disso, os sais do presente projeto contêm um núcleo de piridina que está presente em uma série de compostos bioativos tendo como exemplo drogas já em uso como a estreptonigrina, estreptonigrona e lavendamicina que são apresentadas como tratamento anticancerígeno (GOMHA et al, 2018). Desta forma, o estudo de um composto na forma de sal e que possui o elemento selênio e o núcleo de piridina se mostra promissor. Este está sendo sintetizado por um laboratório parceiro (LASOL-UFPel) e testado por nosso grupo de pesquisa por meio de ensaios in vitro vinculados no projeto anterior (0275542/2021-11) que demonstrou que os 3 sais apresentam atividades antioxidante. Dado exposto, o estudo de novos compostos que possuem o potencial de atenuar o dano oxidativo que está envolvido em diversas condições patológicas ao SNC e também que podem melhorar as caraterísticas farmacêuticas de novos fármacos mostra-se importante pois podem contribuir para as opções de tratamento terapêutico. Ademais, os resultados in vitro sugerem a potencialidade de se testar um sal de piridínio contendo selênio em um modelo de dano oxidativo in vivo que envolve um nível de complexidade maior do ponto de vista fisiopatológico. Com o objetivo de apontar uma nova molécula com atividade antioxidante in vivo, este projeto visa testar os efeitos do tratamento oral com o protótipo da classe – o brometo de 1-(2-oxo-2-feniletil)-2-((fenilselanil)metil)piridín-1-io) (composto 3A) frente ao dano oxidativo cerebral causado pela administração central de NPS. O composto 3A foi selecionado com base em estudos preliminares de ação antioxidante em tecido cerebral de camundongos.

1) Síntese do composto:
O composto utilizado neste projeto ((brometo de 1-(2-oxo-2-feniletil)-2-((fenilselanil)metil)piridín-1-io, 3A) será sintetizado pelo Laboratório de Síntese Orgânica Limpa (LASOL) da UFPel. Será solubilizado em água destilada e utilizado em testes in vivo para avaliar a sua ação na proteção do dano oxidativo induzido pelo NPS.

2) Avaliação frente ao dano oxidativo induzido pelo NPS:
O composto será testado quanto a sua capacidade protetora frente ao dano oxidativo cerebral causado por NPS. Para isso, os animais receberão o composto 3A pela via oral em diferentes doses (20, 50 ou 100 mg/kg, administração única). O grupo controle receberá o veículo (água) e o grupo controle positivo receberá N-acetilcisteína (100 mg/kg, v.o), um antioxidante de uso clínico. Trinta min após, o grupo controle receberá salina pela via intracerebroventricular (i.c.v.) e os demais grupos receberão NPS 0,335 µmol/sítio (i.c.v) (IANISKI et al., 2014; VOGT et al., 2018; CHAGAS et al., 2015). A administração por via i.c.v serão dadas conforme descrito por Laursen e Belknap (1986) e os animais serão previamente anestesiados com isoflurano.
Após uma hora da administração do NPS ou salina os animais serão mortos overdose de isoflurano e o cérebro será imediatamente removido e armazenado em ultra-freezer -80 ºC de onde será retirado apenas no momento das análises bioquímicas. O tecido será preparado conforme a orientação de cada técnica. Este tecido então será utilizado para testes ex vivo para avaliar se os compostos foram capazes de prevenir ou atenuar o dano oxidativo causado pelo NPS.

Grupos experimentais
1. Água + Salina – controle
2. Água + NPS – induzido
3. Composto 3A (20 mg/kg) + NPS
4. Composto 3A(50 mg/kg) + NPS
5. Composto 3A (100 mg/kg) + NPS
6. NAC + NPS – controle positivo

3) Testes ex vivo:

3.1) Dosagem de proteínas: método de quantificação de proteínas de Bradford é baseado na ligação do reagente Comassie blue à proteína sendo monitorado o aumento da absorção no comprimento de onda de 595 nm para determinar a quantidade de proteína no tecido em estudo. Método considerado reprodutível e rápido (BRADFORD, 1976).

3.2) Tiol não-proteico (NPSH): técnica que identifica a diminuição de tióis não proteicos como, por exemplo, a glutationa que desempenha um papel importante na proteção contra o dano oxidativo. A sua diminuição indica possivelmente uma lesão oxidante no tecido (ELLMAN, 1959).

3.3) Determinação dos níveis de nitrito: técnica que permite quantificar a formação de nitrito que é um metabólito estável do óxido nítrico. O óxido nítrico por meio de reações indiretas provoca a formação de produtos oxidantes que podem contribuir para o processo de estresse oxidativo e dano celular (GRANGER et al., 1999).

3.4) Superóxido dismutase (SOD): enzima capaz de converter uma espécie altamente reativa (O2-) em espécies menos danosas para as células. Técnica utilizada para analisar a atividade antioxidante do composto por meio a inibição da auto oxidação de substâncias catalisadas pelo O2- (MARKLUND e MARKLUND, 1974).

3.5) Atividade da enzima Na+, K+ATPase: proteína presente no tecido cerebral e altamente sensível ao estresse oxidativo, desta forma alterações na atividade dessa enzima pode indicar um dano oxidativo (FISK, 1925).

3.6) Níveis de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS): técnica utilizada como medida de peroxidação lipídica por meio da formação de malondialdeído (OHKAWA et al., 1979).

3.7) Determinação de espécies reativas (RS): método espectrofluorimétrico baseado na oxidação do acetato de diclorodihidrofluoresceína (DCHF-DA) em diclorofluoresceína fluorescente (DCF) que é medida para a detecção de espécies reativas intracelular (LOETCHUTINAT et al., 2005).

3.8) Atividade de catalase (CAT): teste espectrofotométrico baseado no monitoramento do desaparecimento de peróxido de hidrogênio (H2O2) (AEBI, 1984).

3.9) Determinação de carbonil de proteínas: teste baseado na reação de carbonilas de proteína com dinitrofenilhidrazina (DNPH) formando dinitrifenilhidrazona. Ocorre um aumento de carbonila em proteínas com modificação oxidativa (LEVINE et al., 1990).

3.10) Atividade da glutationa peroxidase (GPx): ensaio espectrofotométrico baseado na medida da atividade enzimática de forma indireta pelo decaimento de NADPH (WENDEL, 1981).

3.11) Atividade da glutationa redutase (GR): consiste na redução do dissulfeto de glutationa pela glutationa redutase as custas do consumo de NADPH onde a atividade da glutationa redutase é proporcional ao decaimento do NADPH (CARLSBER e MANNERVIK, 1985).

3.12) Atividade de glutationa S-transferase (GST): métodos espectrofométrico utilizado para avaliar a atividade deste antioxidante enzimático de defesa que metaboliza xenobióticos (HABIG et al., 1974).

3.13) Atividade de delta-aminolevulinato desidratase (delta-ALA-D): utilizada para avaliar a ação do composto frente a enzima delta-aminolevulinato desidratase considerada um marcador de toxicidade (SASSA, 1982).

Espera-se encontrar uma molécula com potencial neuroprotetor contra o extresse oxidativo envolvido em diferentes doenças e distúrbios do cérebro como ansiedade e depressão. Espera-se que o sal em estudo reproduza os efeitos antioxidantes observados in vitro também no modelo in vivo e assim seja um composto promissor como alvo terapêutico para o tratamento dessas patologias. Por fim, espera-se contribuir na formação de recursos humanos no PPGBBio e envolver alunos de iniciação científica. Anseia-se pela geração de resumos e artigos científicos.