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O milho (Zea mays L.) é o principal cereal produzido em nível mundial, com utilização dos grãos pela agroindústria, para a produção de alimentos e óleo vegetal, ração animal e na indústria química (WANG et al., 2018; PALACIOS‐ROJAS et al., 2020). Além disso, nos últimos anos tem sido utilizado como fonte
de energia servindo como matéria prima para a produção de etanol (IBETO et al., 2011).
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial deste cereal, reforçando a importância dessa cultura para a economia do país, cuja produção já ultrapassou 115 milhões de toneladas do grão na safra 2021/2022 (CONAB, 2022). Segundo estimativas da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), para 2030/31,
a produção projetada é de 124 milhões de toneladas, podendo chegar a 149,9 milhões (CONAB, 2022).
As maiores limitações para a produção de milho são os problemas fitossanitários como o aparecimento de insetos-praga e doenças que causam danos em diferentes estádios da cultura (DE GROOTE et al., 2020; MUELLER et al., 2020). Os insetos mais comuns são os percevejos fitófagos da família Pentatomidae, as lagartas desfolhadoras como, por exemplo, Spodoptera frugiperda JE Smith e Helicoverpa spp. (Lepidoptera: Noctuidae), a larva-alfinete, Diabrotica speciosa Germar (Coleoptera: Chrysomelidae) (MACHADO et al., 2022) e nos últimos anos a cigarrinha-do-milho, Dalbulus maidis DeLong &
Wolcott (Hemiptera: Cicadellidae) (OLIVEIRA; FRIZZAS, 2021).
A lagarta-do-cartucho-do-milho (Spodoptera frugiperda) é uma das pragas mais conhecidas nas Américas, não apenas causando danos no cultivo de milho, mas em diversas culturas como arroz, trigo, sorgo, algodão e soja (BARROS et al., 2010). O alto grau de polifagia beneficia o inseto quanto à falta de alimento
e apesar da preferência por Poáceas, acabam causando danos significativos em soja principalmente quando esta cultura é estabelecida após o cultivo de milho (BERNARDI et al., 2014).
O Manejo Integrado de Pragas (MIP) é um sistema de decisão para uso de diversas táticas de controle utilizadas de forma conjunta ou isolada, desde que uma não interfira na ação da outra (BORTOLOTTO et al., 2015). O MIP visa aumentar a eficiência de controle, utilizando os métodos mais adequados a
determinadas situações, tendo uma visão mais ampla quanto ao agroecossistema como um todo e levando em conta a sua complexidade (BOTTRELL; SCHOENLY, 2018).
As principais estratégias utilizadas para o controle de S. frugiperda são a utilização de plantas Bt e a aplicação de inseticidas químicos, sendo estes muitas vezes aplicados para controlar outras lagartas, e os mais utilizados são os organofosforados, carbamatos e piretróides (CARVALHO et al., 2013). Apesar
de serem bastante utilizados, os agrotóxicos tem baixa eficácia e podem apresentar falhas no controle devido à alta tolerância dos insetos aos inseticidas (BERNARDI et al., 2014).
Outro método de controle que ocorre de forma natural é o biológico, em que organismos vivos regulam o nível populacional de espécies de insetos através de sua alimentação (predadores) ou como substrato para
desenvolvimento total ou parcial do ciclo deste inseto (parasitoides) (BOSEM BAILLOD et al., 2017). Esses agentes de controle podem ser generalistas ou específicos quanto à presa, sendo que o último tem maior importância em termos de eficiência de controle (NEUMANN et al. 2018).
A seletividade de agrotóxicos aos inimigos naturais é um ponto importante dentro do MIP, onde produtos que controlam a praga, mas não afetam negativamente os organismos benéficos devem ser priorizados (BUENO et al., 2017). Desta forma, dois métodos de controle bem diferentes (químico e biológico) que não seriam eficazes individualmente, podem ser utilizados ao mesmo tempo sem que um diminua a eficiência de controle do outro (TORRES; BUENO, 2018).
O parasitoide de ovos de S. frugiperda, T. remus é considerado um importante agente de mortalidade natural desta praga porque atua na fase de ovo do inseto impedindo a eclosão das lagartas que posteriormente causarão danos (CARNEIRO et al., 2010). Alguns dos principais problemas da não
ocorrência do parasitismo em ovos de S. frugiperda são porque os mesmos são colocados em camadas e contém escamas. A alta taxa de parasitismo apresentada por T. remus é devido à capacidade de entrar nesta massa de ovos e parasitar até as camadas mais inferiores (PEÑAFLOR et al., 2012).
Sendo assim, é necessária a realização de testes de seletividade de agrotóxicos utilizados na cultura do milho e de plantas Bt ao parasitoide de ovos de S. frugiperda que avaliem o efeito subletal não apenas nos parâmetros biológicos como também no comportamento de oviposição para o conhecimento do impacto dos mesmos e a escolha dos melhores agrotóxicos que possam ser utilizados sem comprometer o MIP.

Material e Métodos

Os experimentos serão conduzidos em laboratórios e casa de vegetação pertencentes ao Laboratório de Manejo Integrado de Pragas (LabMIP), do Departamento de Fitossanidade, na Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, e no Laboratório de Zoologia de Invertebrados (LZ-INVERT), do Departamento de
Ecologia, Zoologia e Genética, no Instituto de Biologia, ambos da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Campus Capão do Leão, RS. De maneira geral, os testes quanto à toxicidade aguda dos agrotóxicos serão conduzidos no LabMIP, segundo a metodologia utilizada por Pazini et al. (2019). Os cultivos de milho
serão realizados em casa de vegetação anexa ao LabMIP. Os testes para a avaliação comportamental dos parasitoides serão conduzidos no LZ-INVERT. A seguir serão demonstradas as especificidades metodológicas que serão adotadas para avaliação da toxicidade de inseticidas sobre T. remus.

1. Criação dos insetos

1.1. Criação do hospedeiro Spodoptera frugiperda
Para a multiplicação do hospedeiro natural S. frugiperda proveniente do Laboratório de Biologia de Insetos (Labio-UFPel), as lagartas serão mantidas em dieta natural (milho convencional) e artificial de Greene et al. (1976), sendo esta composta pelos seguintes ingredientes: feijão, gérmen de trigo, proteína de soja,
levedura de cerveja, caseína, ágar, solução vitamínica Vanderzant, formaldeído (40%), ácido sórbico, ácido ascórbico, nipagin (metilparahidroxibenzoato) e tetraciclina. A dieta será vertida em placas de bioensaio com 16 células (5,5 centímetros de comprimento x 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de
altura por poço) [(Advento do Brasil, São Paulo, Brasil)], para posterior inoculação das lagartas, onde permanecerão até a fase de pupa, em condições ambientais controladas (25±1 C°; 70±10% UR; fotofase: 14 h). As pupas serão acondicionadas em caixas Gerbox® (12 x 12 x 4 cm), com papel de filtro no fundo para a manutenção da umidade, em câmaras climatizadas tipo B.O.D. (25±1 °C; 70±10% UR; fotofase: 14 h), onde permanecerão até a emergência dos adultos.
Após a emergência, os adultos serão mantidos em gaiolas cilíndricas de PVC (20 cm x 20 cm), revestidas internamente com papel filtro (substrato de oviposição), sendo fechadas na superfície superior com tecido tipo “voile” e alimentadas com solução aquosa de mel a 10%. As posturas serão retiradas do
substrato de oviposição a cada dois dias e acondicionadas em placas de Petri contendo dieta artificial, até a eclosão das lagartas. Para a criação de populações resistentes às proteínas Bt, a metodologia de criação será a mesma utilizada para a população suscetível, exceto a dieta para as lagartas que será ofertada a
partir das respectivas plantas Bt.

1.2. Criação do parasitoide Telenomus remus
Os parasitoides serão criados e multiplicados seguindo metodologia adaptada de Stecca et al. (2016). Em uma sala com ambiente controlado (25±1 C°; 70±10% UR; fotofase: 14 h), os parasitoides serão criados em gaiolas, com cerca de 200 fêmeas/gaiola, confeccionadas com tubos de vidro (30 x 10 cm) fechados em suas extremidades por tampões de cortiça cobertos com tecido preto. Em cada extremidade um pedaço de 5 cm será coberto por fita preta para permitir o mais fácil manuseio dos insetos sem que escapem da gaiola e prover um refúgio a luz. Os parasitoides serão alimentados com um filete de mel em
pedaços de cartolina e a eles serão oferecidos ovos de S. frugiperda diariamente, oriundos da criação citada anteriormente. Serão oferecidos aproximadamente 1000 ovos para cada 40 fêmeas de parasitoides com mais de dois dias de emergência, para garantir que as fêmeas tenham copulado, por um período de
exposição de 6 horas. Parte dos ovos parasitados será destinada a testes de toxicidade e parte formará novas gaiolas para manutenção da criação.

2. Inseticidas
Utilizar-se-ão três formulações comerciais de inseticidas para avaliar a toxicidade aguda sobre T. remus, em condições de laboratório (Tabela 1). Os inseticidas encontram-se registrados para o controle de Spodoptera frugiperda na cultura do milho no Brasil e são amplamente utilizados no manejo desse
inseto (BRASIL, 2022).

3. Cultivares Bt
Utilizar-se-ão duas cultivares de milho Bt, VT PRO™ e Viptera® que serão cultivadas em casa de vegetação em vaso plástico (1 planta/vaso) de 10L contendo terra e substrato vegetal na proporção de 1:1. Os tratos culturais serão adotados de acordo com a recomendação para a cultura. No estágio fenológico
V6, as folhas serão retiradas no terço superior das plantas e oferecidas as lagartas.

4. Bioensaios de toxicidade aguda letal a Telenomus remus
As concentrações de cada inseticida que serão utilizadas nos ensaios serão baseadas no nível de ingrediente ativo indicado no rótulo da embalagem das formulações e serão preparadas em duas fases. A primeira fase consistirá em diluições seriadas (1:10) da concentração de estoque de inseticida (1000
ng ia.cm-2) para obter a faixa de doses causadoras de mortalidade entre 0 a 100%. Na segunda fase, sete a dez concentrações de cada inseticida serão preparadas por diluição sequencial em água destilada para obter as curvas de concentração-resposta e as concentrações letais estimadas (CL50). Água destilada será utilizada no tratamento controle.

4.1. Bioensaios de contato tarsal
O método que utiliza frasco de vidro, inicialmente desenvolvido para avaliar a suscetibilidade de Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Hemiptera: Miridae) e E. heros (IRAC, 2014) à inseticidas, utilizado para determinar a toxicidade de inseticidas sobre T. podisi (SNODGRASS, 1996), será empregado em testes de toxicidade aguda letal para T. remus, via contato tarsal, no laboratório (temperatura: 25±1 °C; UR: 70±10%; fotofase: 14: h).
Os tubos de vidro (1,0 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura= 25,91 cm2) serão impregnados com 600 μL da solução do inseticida de cada tratamento (concentrações de inseticidas). A secagem da calda será realizada em equipamento com rotação, visando à uniformidade da distribuição do inseticida no tubo. Cada tratamento incluirá cinco repetições, cada uma com cinco casais (machos e fêmeas) de adultos parasitoides com idade ≤48 h.
Os parasitoides serão removidos dos frascos contaminados após quatro horas de exposição e transferidos para outros frascos de vidro (diâmetro de 2,4 cm e altura de 8,0 cm) contendo mel puro como alimento. A mortalidade será determinada em 24 horas após a exposição. Considerar-se-ão mortos os
parasitoides que mostrarem incapacidade de locomoção, mediante estímulo por intermédio de pincel com ponta fina.

5. Bioensaios de toxicidade aguda subletal a Telenomus remus

5.1. Bioensaios de contato tarsal
Os casais de T. remus serão mantidos por 24 h em frascos de vidro (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento para o acasalamento. Posteriormente, fêmeas (acasaladas, alimentadas e sem experiência de forrageamento com o hospedeiro) serão transferidas para frascos de vidro (1,0 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura= 25,91 cm2) impregnados com as CL50 dos inseticidas, determinadas com base no item 4.1, ou água destilada (tratamento controle). O delineamento experimental será inteiramente casualizado com cinco repetições com 20 fêmeas cada serão usadas.
Após 4 h de exposição aos inseticidas (CL50), os parasitoides serão removidos dos frascos de vidro e transferidos para outros frascos (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento. Quinze fêmeas sobreviventes, selecionadas aleatoriamente a partir de cada tratamento, serão transferidas para o frasco de vidro do mesmo tamanho que conterá mel puro como alimento e após 24 horas (após a exposição) serão transferidas individualmente para a placa de Petri com massa de ovos (idade <12 h) de S.
frugiperda para avaliação do comportamento de oviposição e parasitismo da geração F0, e emergência e sobrevivência (longevidade) da geração F1.

6. Bioensaio comportamental de oviposição de Telenomus remus

6.1. Sem interferência
Os casais de T. remus serão mantidos por 24 h em frascos de vidro (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento para o acasalamento. Posteriormente, quinze fêmeas (acasaladas, alimentadas e sem experiência de forrageamento com o hospedeiro) serão transferidas individualmente para placas de Petri (60x15mm) com uma massa de ovos (<12 horas e 20 ovos) no centro da placa. A partir desse momento, todos os movimentos da fêmea em relação aos ovos serão registrados através do
Estereomicroscópio Zeiss Discovery V20 e a filmagem terminará assim que a fêmea abandonar a massa de ovos. Com as filmagens prontas, será realizada uma análise detalhada dos movimentos e ações das fêmeas com o objetivo de estabelecer padrões do comportamento de oviposição de T. remus em ovos de
S. frugiperda. Os arquivos de filmagem serão nomeados com o código dos indivíduos e analisados em software de edição de imagem. Os vídeos obtidos em formato .MPEG serão convertidos para o formato .AVI através da plataforma auxiliar online Video Converter do Google para serem analisados no software VirtualDub, o qual só permite arquivos no formato .AVI. Os vídeos serão reduzidos a 10 frames por segundo para facilitar a visualização dos movimentos do inseto. Os frames serão importados para o software ImageJ 1.52, o qual possibilita a análise frame por frame com a marcação do percurso
realizado pela fêmea através do pacote MTrackJ do próprio software.

6.2. Com interferência
A partir do conhecimento dos padrões comportamentais de oviposição das fêmeas de T. remus sem influência dos inseticidas e plantas Bt, serão realizados testes sob influência destes fatores. As fêmeas serão contaminadas com cada inseticida e o comportamento de oviposição será observado em ovos
de S. frugiperda alimentadas com cada cultivar de milho Bt.

Metas a serem alcançadas

- Conhecer o comportamento alfa de oviposição de T. remus no período de 24 meses;
- Recomendar alguns agrotóxicos para serem utilizados na cultura do milho pelo fato de não possuírem efeitos subletais ao parasitoide T. remus no período de 48 meses;
- Indicar o uso de plantas Bt e inseticidas juntamente com controle biológico, sem que afete a biologia e o comportamento de T. remus no período de 48 meses;
- Conseguir base científica no período de 48 meses que apoie a utilização de agrotóxicos notavelmente seletivos aos parasitoides de ovos, com base em testes de laboratório, no manejo integrado de pragas da cultura do milho.


Impactos esperados

1. Impactos econômicos
O conhecimento e utilização de agrotóxicos seletivos ao parasitoide de ovos T. remus permitirá o aumento da população desse inimigo natural no campo, e consequentemente, a diminuição da população de S. frugiperda. Com isso haverá redução do uso de inseticidas, evitando a resistência e ressurgência
de pragas, o que diminuirá os custos de produção na lavoura de milho.

2. Impactos sociais
A informação dos agrotóxicos seletivos aos inimigos naturais como o parasitoide T. remus por parte do produtor rural, possibilitará o manejo racional desses inseticidas aplicados na cultura, assim como, melhorias na qualidade final do produto e das condições de vida do produtor.

3. Impactos ambientais
A utilização de agrotóxicos seletivos a inimigos naturais causará um menor impacto no agroecossistema e no ambiente como um todo. A redução do uso de agrotóxicos não seletivos proporcionará um ambiente mais estável, ocorrendo possível harmonia entre o controle químico e biológico, favorecendo o controle biológico natural conservativo e também a diminuição dos resíduos químicos nos grãos, além de uma maior segurança ambiental.