Nome do Projeto
Avaliação das alterações anatomopatológicas de órgãos de ratos submetidos a diferentes métodos de eutanásia
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
18/07/2022 - 19/07/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
As alterações em órgãos e/ou tecidos induzidas pelos métodos de eutanásia estão correlacionadas especialmente com o estresse durante o procedimento ou alterações físicas e paramétricas causadas por cada agente (Pierozan et al. 2017; Shomer et al. 2020). Nessa perspectiva, o objetivo desse projeto de pesquisa é descrever as alterações anatomopatológicas de diferentes órgãos de ratos submetidos a diferentes métodos de eutanásia, buscando avaliar a interferência dos fármacos e métodos e assim auxiliar os pesquisadores na melhor escolha para a sua pesquisa. Este projeto será um ensaio experimental randomizado. Os animais utilizados serão da espécie Rattus norvergicus linhagem wistar oriundos do biotério central da Universidade Federal de Pelotas. Os animais serão distribuídos em seis grupos, sendo eles método físico de guilhotina e métodos químicos inalatórios com gás carbônico, isoflurano e sevoflurano, e injetáveis com pentobarbital e propofol. No dia do procedimento os animais serão aleatoriamente randomizados, tomando o cuidado para selecionar nos diferentes grupos, animais de todas as linhas e colunas das gaiolas, para garantir que a maior ou menor exposição à luz, temperatura ou umidade não sejam fatores de viés na pesquisa. O método físico será realizado com sedação prévia, com cetamina (75mg/kg) e xilazina (2.5mg/kg) por via intraperitoneal (Molina et al. 2015). Os métodos inalatórios serão realizados dentro de câmaras de eutanásia com um fluxo contínuo de ar comprimido misturado ao gás carbônico (50%), isoflurano (5%) e sevoflurano (8%), medidos por meio de analisador de gases. Após atingir o decúbito as concentrações dos agentes inalatórios serão aumentadas gradativamente até a parada cardíaca. Já os métodos injetáveis serão realizados com contenção amigável para administração de pentobarbital (800mg/kg) e propofol (250mg/kg) por via intraperitoneal. Ainda, a partir da administração dos anestésicos injetáveis, se os animais não apresentarem parada cardíaca completa após cinco minutos, será realizada nova administração de com adição de 30% da dose administrada previamente. Durante todos os procedimentos, a partir da indução anestésica, o comportamento dos animais será filmado, e os tempos até o decúbito e a partir deste até a parada cardíaca serão mensurados. Durante a eutanásia com os agentes inalatórios os animais serão colocados nas câmaras conectadas ao fluxo de cada agente e após alcançarem o decúbito será utilizada máscara facial para permitir manipulação sem interferir na concentração alveolar do agente. Para verificação do momento exato da parada cardíaca, os animais serão conectados ao eletrocardiograma (ECG), exceto nos animais que será realizado a guilhotina, já que o ECG só será utilizado após o a decapitação para constatar a parada cardíaca. Serão excluídos do estudo aqueles animais que necessitarem de doses adicionais de fármacos injetáveis, ou se apresentarem alterações clínicas antes ou durante a aplicação do método. Os parâmetros mensurados serão, o comportamento dos animais durante a realização da eutanásia, tempo até o decúbito e tempo até a morte, mensurados pela visualização direta a partir do início da eutanásia até a parada cardíaca completa verificada pelo ECG. Imediatamente após a eutanásia os órgãos de interesse serão coletados e armazenados em formol a 10%, para posterior processamento e coloração com o método padrão de Hematoxilina e Eosina e avaliação histopatológica. A análise estatística será realizada com o software GraphPad Prism. Serão realizados testes de normalidade , sendo eles: ANOVA e post-hoc de Tukey ou Kruskal-Wallis e post-hoc de Dunn, respectivamente.

Objetivo Geral

Objetivo geral:
Relacionar os métodos de eutanásia com as alterações anatomopatológicas em diferentes órgãos
de ratos.
Objetivos específicos:
-Descrever e comparar o comportamento durante a eutanásia com os diferentes métodos.
-Quantificar o tempo que leva até os animais atingirem inconsciência e parada cardíaca.
-Realizar uma descrição detalhada das alterações histológicas relacionadas com cada método.
-Diferenciar como cada método afeta os diferentes órgãos.

Justificativa

A pesquisa científica necessita da utilização de animais experimentais em diferentes áreas do
conhecimento (Shomer et al. 2020). Contudo, a forma com que os experimentos vêm sendo
conduzidos mudou ao longo do tempo, especialmente a partir do consenso de que animais não
humanos também são seres sencientes (Lewejohann et al. 2020). Nos dias de hoje, a
experimentação animal é uma questão ética e segue legislação específica, para assim evitar o
sofrimento desnecessário aos animais experimentais, norteando experimentos com técnicas
humanizadas (Resolução Normativa Nº 33, de 18/11/2016). Nesse contexto, um dos pontos chaves
na utilização de animais em pesquisa é a eutanásia, que segundo recomendação do Guia de boas
práticas animais do CFMV, faz uso de fármacos anestésicos como métodos recomendados de
eutanásia (Conselho Federal de Medicina Veterinária, 2013). Contudo, eventuais alterações
geradas pela utilização dessas técnicas e fármacos precisam ser conhecidas (Shomer et al. 2020).
Podemos dividir os métodos de eutanásia nos roedores em métodos físicos e farmacológicos ou a
combinação de ambos (Sikes et al. 2016; Leary, 2020). Dentre os métodos físicos destacam-se a
guilhotina e o deslocamento cervical, que devem ser realizados sob sedação em animais com peso
acima de 150 gramas (Recomendação da União Europeia 2010; Shomer et al. 2020). Já os métodos
químicos podem ser divididos em inalatórios e injetáveis. Sobre os métodos inalatórios, os mais
utilizados são gás carbônico associado ou não ao isoflurano e sevoflurano, que também podem ser
utilizados de maneira isolada (1Boivin et al. 2017; 2Boivin et al. 2017; Marquardt et al. 2018). Entre
os métodos injetáveis, o padrão ouro na eutanásia de roedores ainda é a administração
intravenosa ou intraperitoneal de pentobarbital na dose de 800 mg/kg em uma diluição de 200
mg/mL (Mohamed et al. 2020). Ainda podemos citar o propofol sendo um anestésico geral
injetável, que tem potencial para ser utilizado na eutanásia, mas que foi pouco estudado (Zhou et
al. 2013). Também é importante ressaltar a importância da adequação dos métodos de eutanásia
em relação a metodologia da pesquisa. Quando todas as avaliações são ante mortem e após a
eutanásia os corpos são descartados, o método ainda deve buscar o menor sofrimento possível
com técnicas humanizadas que seguem as resoluções normativas vigentes. Contudo, quando as
avaliações da pesquisa também serão realizadas, ou serão apenas realizadas no post mortem,
além da necessidade de respeitar a legislação, a escolha da técnica de eutanásia pode afetar
diretamente os resultados da pesquisa. Acreditamos que cada pesquisador após definir os órgãos
e parâmetros que serão avaliados, devem selecionar o método de eutanásia que tenha o menor
impacto possível sobre os resultados e que esses sejam de conhecimento prévio. Neste contexto,
se faz necessária uma revisão sistemática de estudos sobre alterações relacionadas com cada
método, além de realizar novos estudos para refinar a metodologia de cada pesquisa. Portanto, ao
final desta pesquisa, espera-se correlacionar eventuais alterações comportamentais e
anatomopatológicas com o método de eutanásia aplicado e compará-las com pesquisas
semelhantes (1Boivin et al. 2017; 2Boivin et al. 2017; Marquardt et al. 2018; Mohamed et al. 2020;
Laferriere et al. 2020).

Metodologia

Relato breve de todos os procedimentos com os animais
Os animais ficarão em seus respectivos alojamentos sem quais quer intervenções além da
interação para manutenção do bem estar e ambientação entre o pesquisador e os animais. No dia
da eutanásia os animais serão aleatoriamente distribuídos como já exposto em seis grupos de dez
animais cada grupo, sendo eles: grupo guilhotina, isoflurano, sevoflurano, gás carbônico,
pentobarbital e propofol. No grupo guilhotina, os animais serão sedados previamente com
cetamina e xilazina, e colocados nas mesmas câmaras de eutanásia dos demais métodos com
medidas (C X L X A) em mm: 400 x 300 x 300, após o animal atingir o decúbito será realizada a
secção da região cervical. Nessa mesma câmara serão realizadas as eutanásias nos animais dos
grupos gás carbônico, isoflurano e sevoflurano, nas concentrações de 50% (atingida por Blender
com mistura de CO2 e ar comprimido), 5% e 8% (vaporizada por um vaporizador universal e
verificada por meio de um analisador de gases), respectivamente. Os animais dos grupos
pentobarbital e propofol, receberão por via intraperitoneal 800 e 250 miligramas por quilo,
respectivamente, então serão colocados na mesma câmara de eutanásia supracitada. Como
discutido anteriormente, se os animais não apresentarem parada cardíaca completa após cinco
Referências
1BOIVIN G. P. et al. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods
in C57BL/6NTac male mice. J Am Assoc Lab Anim Sci, v.56, n.1, p.69-78, 2017.
2BOIVIN, G. P. et al. Physiological, behavioral, and histological responses of male C57BL/6N mice to
different CO2 chamber replacement rates. J Am Assoc Lab Anim Sci. v.55, n.10, p.451-461, 2017.
BRASIL. Resolução Normativa nº 33, 18 de novembro de 2016. Baixa o Capítulo "Procedimentos -
Roedores e Lagomorfos mantidos em instalações de instituições de ensino ou pesquisa científica" do
Guia Brasileiro de Produção, Manutenção ou Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou
Pesquisa Científica.
Conselho Federal de Medicina Veterinária. Guia Brasileiro de Boas Práticas para Eutanásia em
Animais. Brasília: Comissão de Ética, Bioética e Bem-Estar Animal/CFMV, 2013.
European Union. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22
September 2010 on the Protection of Animals Used for Scientific Purposes.
LAFERRIERE, C.; PANG, D. Review of Intraperitoneal Injection of Sodium Pentobarbital as a Method of
Euthanasia in Laboratory Rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal
Science. v.59, n.3, p.254-263, 2020.
LEARY, S. AVMA Guidelines for the Euthanasia ofAnimals: 2020 edition, 2020.
LEWEJOHANN, L. et al. Impulse for animal welfare outside the experiment. Lab. Anim. v.54, n.2,
p.150-158, 2020.
minutos da administração dos fármacos injetáveis, será realizada nova administração de com
adição de 30% da dose. Os tempos de decúbito de todos os grupos, inclusive do grupo guilhotina,
será mensurado, a partir daí, nos grupos gás carbônico, isoflurano, sevoflurano, pentobarbital e
propofol, será colocado o sensor de um doppler vascular para verificar o momento exato da
parada cardíaca, que também será contabilizado. Ainda, nos grupos gás carbônico, isoflurano e
sevoflurano, após atingirem o decúbito, para colocação dos eletrodos do ECG sem prejudicar a
concentração dos agentes, será conectada uma máscara facial ao fluxo de ar e colocada
diretamente na face do animal. Após verificada a eutanásia, os órgãos de interesse supracitados
serão coletados imediatamente por meio de necropsia

Indicadores, Metas e Resultados

Uma vez que as alterações relacionadas com os diferentes métodos de eutanásia sejam
conhecidas, deixaram de ser um viés, o que ajudará a refinar a pesquisa com animais
experimentais e consequentemente diminuirão o número de animais utilizados. Outro ponto é
que, uma vez distinguindo quais alterações estão relacionadas com o método de eutanásia
empregado, os pesquisadores não precisarão deixar de utilizar fármacos sedativos e anestésicos
diminuindo assim o estresse durante procedimentos físicos. Desta forma, o conhecimento mais
aprofundado sobre as alterações relacionadas à eutanásia, possibilitarão aos pesquisadores uma
melhor escolha do método a ser utilizado.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ALINE DO AMARAL
FABIANE BORELLI GRECCO1
GUSTAVO ANTÔNIO BOFF
JÚLIA VARGAS MIRANDA
MARTIELO IVAN GEHRCKE1
VANDRESSA MASETTO
VITÓRIA BAIERLE MAGGI

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