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A glicosilação aberrante medeia uma infinidade de processos associados ao desenvolvimento tumoral, incluindo adesão célula-célula, invasão e metástase, vigilância imunológica e metabolismo do câncer (Pinho e Reis, 2015). As células malignas exibem mudanças profundas em seu glicoma e, de fato, essas mudanças são consideradas uma parte essencial da oncogênese. Em células normais e saudáveis, carboidratos como a high-mannose – na qual 5-9 moléculas de manose estão ligadas a uma asparagina (N) – são cortadas na jornada através do retículo endoplasmático (ER) e do Golgi. Em relação à N-glicosilação apresentada pelas células cancerosas, a manose ramificada não processada (como a high-mannose) tem especial relevância. Por outro lado, a O-glicosilação ligada refere-se à ligação de moléculas de açúcar ao átomo de oxigênio de serina ou treonina e, menos frequentemente, tirosina. Certos O-glicanos são apresentados na superfície celular das células cancerígenas como formas anormalmente truncadas (de Leoz et al., 2011; Ferreira et al., 2017; Liu et al., 2013). Contrastando com a N-glicosilação, a O-glicosilação no câncer é caracterizada pela presença de estruturas de carboidratos truncadas. As estruturas mais comumente encontradas são o antígeno T (também denominado TF) e o antígeno Tn, que decoram a superfície celular de câncer de cólon, colo do útero, mama, pulmão, bexiga, ovário, estômago e próstata , enquanto as células normais não abrigam essas estruturas (Fu et al., 2016). Outras modificações identificadas em células cancerosas incluem a fucosilação aumentada e mudanças nos padrões de sialiação (Lise et al., 2000; Liu et al., 2011)

2.1.Construção de gene sintético XCL, construção de quimera, análise in silico e expressão recombinante:
A quimera H84T-XCL será construída usando as sequências de H84T-Banlec (Uniprot ID: O22321) e da lectina de Xerocomus chrysenteron (XCL) (Uniprot ID: Q8WZC9), conectadas por um linker flexível ou rígido. A cauda de histidina (His6x-tag) será adicionada na porção C-terminal para possibilitar a recuperação de proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Um sítio de restrição para corte enzimático e separação das proteínas será inserido logo após o linker. (Figura 3). A quimera e a XCL recombinante (rXCL) serão modeladas no AlphaFold (Jumper et al., 2021) através do ColabFold ( https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/beta/AlphaFold2_advanced.ipynb ).

Figura 3. Construção da Quimera. As sequências de DNA referentes à H84T (azul) e XCL (verde), recuperados do banco de dados Uniprot serão conectados através de um linker (vermelho) e inseridos no vetor pET-28a (+) e o marcador de histidina (His6x) estará localizado no C-terminal.

Parâmetros bioquímicos como massa molecular e ponto isoelétrico serão obtidos com a ferramenta ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/). Vamos avaliar a solubilidade da proteína através do Protein-sol (Hebditch et al., 2017), realizar docking molecular para avaliar as interações proteína-proteína usando o webserver ClusPro (Kozakov et al., 2017) e estabelecer a estrutura quaternária mais favorecida. É possível que a forma monomérica das proteínas seja apenas um dos arranjos esperados e a quimera atinja sua maior atividade de ligação como um dímero, como já visto para H84T. Faremos simulações de dinâmica molecular através do GROMACS (Abraham et al., 2015) para observar possíveis comportamentos biofísicos, como estabilidade e preferência de temperatura.
As sequências dos genes rXCL e da quimera serão expressas através de gene sintético inserido no vetor pET-24(+) e transformado em Escherichia coli. A expressão e a purificação ocorrerão de acordo com os protocolos já estabelecidos (da Silva Pinto et al., 2019). Para confirmar o arranjo quaternário das formas ativas, bem como o sucesso da expressão recombinante, ambas as proteínas serão avaliadas por meio de eletroforese SDS-PAGE e Western blotting.

2.2 Triagem de especificidade de ligação a carboidratos:
Os seguintes mono-, di- e oligossacarídeos serão testados quanto à inibição da hemaglutinação, de acordo com protocolos estabelecidos para ambas as proteínas (Damian et al., 2005; Swanson et al., 2015): manose, galactose, frutose, glicose, lactose, high-mannose, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, fetuína e asialofetuína (contém o antígeno Tn). Em cada tubo, 50 µl de uma diluição em série de duas vezes dos açúcares simples em tampão serão adicionados a um volume igual de solução de lectina e incubados 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, serão adicionados 50 µL da suspensão de eritrócitos, em que a aglutinação será avaliada.

2.3. Atividade antitumoral:
Para os testes de atividade antitumoral, serão selecionadas linhagens celulares normais e derivadas de tumores com expressão superficial de high-mannose, antígeno Tn ou ambos. Isso inclui células já disponíveis, como fibroblastos murino e humano (3T3 e HFF-1), ovário de hamster chinês (CHO), células renais caninas (MDCK), sarcoma de células reticuladas (J774) melanoma (A375), câncer de mama (MCF-7) (da Silva Pinto et al., 2019; Lacerda et al., 2017; Monte et al., 2014; Reis et al., 2014; Silva et al., 2014). É possível també, através de parceira com a Universidade de Michigan, testar a chimera e rXCL em células de câncer de pulmão (A549, H1975, HCC827), adenocarcinoma de cólon (HT-29), leucemia mieloide aguda (HL-60) e células de câncer pancreático (Capan-1 e CFPAC-1).
Os testes de atividade antitumoral serão realizados na ausência (controle) ou presença de H84T, rXCL e H84T-XCL. Cada linhagem celular será cultivada por 48h em meio de cultura adequado em placa de 96 poços de fundo plano, enriquecida com 1% de antibiótico (Estreptomicina 10⁴ μg.mL -1 e Penicilina 10⁴ U.mL -1 ), 10% de soro fetal bovino e cinco concentrações de cada lectina (0,1 μ g.mL -1 a 0,01 μ g.mL -1 ). A proliferação celular será avaliada por contagem de células nos dias 0, 3, 4, 5, 6, 7 e 10. Após o tratamento das células com 10 μL de MTT, a placa de cultura será lida em um espectrofotômetro e os dados de densidade celular serão ser submetidos à análise estatística pelo método de Dunn, utilizando o programa SigmaStat v3.1. Os resultados da atividade citotóxica serão avaliados utilizando os softwares estatísticos GraphPad PRISM 4 e SPSS versão 9.0 para Windows. Quando o crescimento de células cancerosas é inibido pela(s) lectina(s), avaliaremos se a apoptose, senescência, autofagia ou outros mecanismos de morte celular são induzidos pelo composto.

Metas
- Construir e expressar a lectina quimera XCL recombinante e H84T-XCL em Escherichia coli ;
- Avalia a capacidade da XCL e da quimera de ligar açúcares simples e complexos e na hemaglutinação;
- Testar a mitogenicidade e toxicidade de XCL e quimera em linhas celulares normais;
- Avaliar a atividade antiproliferativa in vitro de ambas as moléculas em múltiplas linhagens celulares de câncer;

Indicadores:
-Construir o vetor para expressão da lectina ciborgue em bactérias no primeiro ano do projeto;
-Produzir e caracterizar a lectina ciborgue em relação suas características fisico-químicas ainda no primeiro ano do projeto;
-Testar a atividade da proteína contra pelo menos uma linhagem de célula tumoral no segundo ano do projeto;
-Testar a atividade biológica da lectina contra outras linhagens celulares e organismos, definindo a via de atuação nos anos seguintes.
-Solicitar pelo menos uma patente de invensão.