Nome do Projeto
Avaliação da atividade antiviral de lectinas nativas e recombinantes frente a agentes virais de importância veterinária
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
31/08/2022 - 31/12/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
As lectinas são proteínas que se ligam à estruturas específicas de carboidratos, mas não possuem atividade enzimática. Muitas lectinas inibem a replicação de vírus interagindo com glicoproteínas do envelope viral. Tais lectinas antivirais foram identificadas em bactérias, plantas e algas marinhas. Lectinas da Família das Lectinas Relacionadas a Jacalinas (LRJ) são as mais promissoras, com potencial antiviral. Dentre elas, a lectinas de banana (BanLec) tem destaque para este fim. No entanto poucos estudos com vírus de importância veterinária foram realizados. Com isso, o objetivo do presente trabalho será verificar a ação de lectinas recombinants desenhadas para a produção heteróloga em bacteria. Nosso grupo já tem testado a ação de lectinas nativas e pretende, a partir da otimização in silico, produzir lectinas capazes de inibir dois virus de importância veterinária, o Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) e o Alfaherpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1), responsáveis por grandes perdas econômicas na pecuária. As concentrações das lectinas utilizadas nos ensaios antivirais serão baseadas no ensaio de citotoxicidade, através da redução do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl) -2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo). Os ensaios de atividade antiviral serão realizados através da exposição da célula de rim bovino (MDBK) às lectinas, em diferentes concentrações, antes e depois da infecção viral, avaliadas por redução do MTT e pelo título viral. Os resultados da atividade antiviral ajudarão a entender os mecanismos de ação das lectinas obtidas nesse trabalho além de possibilitar estudos futuros para outros virus, inclusive virus humanos como Herpes e SarS-CoV-2.

Objetivo Geral

Analisar a ação antiviral e virucida de duas lectinas da família das Jacalinas, em suas formas nativa e recombinantes, frente ao vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e ao Herpes vírus bovino do tipo 1 (BoHV-1), assim como analisar o mecanismo de ação antiviral destas proteínas.

Justificativa

As infecções virais geram diferentes consequências negativas na eficiência do sistema reprodutivo bovino refletindo diretamente nas indústrias de corte, leite e laticínios. Os quadros virais podem gerar desde casos de sintomatologia leve que podem passar despercebidos e não diagnosticados até surtos de abortos no rebanho (NEWCOMER; GIVENS, 2016). O controle de doenças infecciosas reprodutivas é economicamente importante para a indústria pecuária, visto que uma variedade de patógenos podem causar quadros que afetam de diferentes maneiras todas as etapas de produção da indústria (KELLING, 2004).
O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) pertence ao gênero Pestivirus e a família Flavivirus (HAY et al., 2016). O BVDV é um patógeno relevante que pode causar doenças reprodutivas, respiratórias e gastrointestinais em bovinos. Muitas das infecções agudas pelo vírus são assintomáticas, entretanto o animal pode apresentar sinais como inapetência, ulcerações orais, diminuição da produção de leite, diarreia, abortos, morte embrionária, teratogênese, quadros respiratórios, disfunção do sistema imunológico e até mesmo, chegar a óbito (PELLERIN et al., 1994; RODNING et al., 2012). O vírus é transmitido de maneira horizontal ou vertical, através da inalação ou ingestão de secreções e fluídos corporais (secreções nasais, urina, leite, sêmen, saliva, lágrimas e fluídos fetais) dos animais infectados (KELLING, 2004; MEYLING; HOUE; JENSEN, 1990).
O BVDV através de suas cepas não-citopáticas de qualquer dos seus genótipos estabelece imunotolerância em fetos durante o primeiro trimestre gestacional o que resulta em animais persistentemente infectados (PI). Quando a prenhe é exposta ao vírus ocorre um processo infeccioso viral agudo capaz de atravessar a placenta, assim infectado o feto. Para que a persistência da infecção seja instituída é necessário que a infecção ocorra antes da maturação do sistema imunológico fetal; infecções posteriores sofrem cleareance viral e o bezerro nasce com imunidade ao BVDV. Assim sendo, os animais PI são classificados como a fonte primária de disseminação do vírus em rebanhos domésticos (MCCLURKIN et al., 1984; NEILL et al., 2011).
Outro importante vírus é o Herpes vírus bovino do tipo 1 (BoHV-1), este faz parte do gênero Varicellovirus, família Herpesviridae e subfamília Alphaherpesvirinae (NANDI et al., 2009). O BoHV-1 é conhecidamente o responsável por três síndromes infecciosas no gado: rinotraqueite bovina infecciosa (RBI), vulvovaginite pustular infecciosa e balanopostite pustular infecciosa; além disso também pode ser responsável por abortos, casos de conjuntivite, infertilidade e encefalite, além de ser um dos patógenos responsáveis pela síndrome chamada de “febre do transporte” (JONES; CHOWDHURY, 2008; YATES, 1982).
A transmissão do BoHV-1 se dá majoritariamente através do contanto com fluídos biológicos, principalmente exsudatos nasais, perdigotos de tosse, secreções genitais, sêmen, líquidos fetais e tecidos; além disso, o vírus pode se manter viável por até 1 ano em sêmen congelado a -196ºC (NANDI et al., 2009). Uma característica importante dos Herpesvírus é sua capacidade de estabelecer latência em seus hospedeiros após um quadro de infecção primária; nos animais isso pode ocorrer tanto com um isolado de campo, ou com uma cepa atenuada através da vacinação. Julga-se que a latência se desenvolve em praticamente todos os animais sejam eles infectados com pequenas ou grandes quantidades do vírus, de maneira atenuada ou virulenta (PASTORET et al., 1982).
Animais que se recuperam de uma infecção pelo BoHV-1 podem ser bastante contraproducentes para o rebanho, visto que se tornam portadores silenciosos do vírus por toda vida. Uma vez que recebem tratamentos imunossupressores ou outras condições desconhecidas reativem a infecção viral, acabam por disseminar o vírus entre os animais do rebanho. Além disso, animais com quadro de RBI podem apresentar diminuição de peso, diminuição na produção de leite e restrições no comércio internacional de gado; visto isso, percebe-se que animais portadores de BoHV-1 são um fator preocupante no que condiz o fator econômico da indústria de gado (VAN OIRSCHOT, 2011; PRESTON; NICHOLL, 2008).
O BVDV está distribuído mundialmente e causa infecção em um grande número de animais ruminantes, assim como em não-ruminantes (NEILL et al., 2011); a literatura demonstra que vários subgenótipos do BVDV prevalecem em diferentes regiões e países, e ao menos 25 subgenótipos de BVDV-1 e BVDV-2 já foram descritos (YESILBAG; ALPAY; BECHER, 2017). A prevalência de infecção por BoHV-1 no mundo é alta e pode variar de acordo com diferentes medidas de controle adotadas (LUCCHESE et al., 2016). Um estudo uruguaio que avaliou a taxa de exposição dos rebanhos ao BVDV e ao BoHV-1, pela análise de anticorpos, demonstrou que 37% dos animais possuíam anticorpos para o BoHV-1, e 69% para o BVDV; além disso os autores do estudo destacam que apenas 3% do rebanho bovino do país é comumente vacinado contra estes patógenos (GUARINO et al., 2008).
No Brasil, de acordo com a literatura, os vírus estão amplamente disseminados entre o gado; Campos e colaboradores encontraram uma prevalência de 82,8% de infecção por BoHV-1 ao analisarem amostras de soro do nervo trigêmeo, onde o vírus normalmente estabelece latência, de 200 animais do Rio Grande do Sul, utilizando técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (CAMPOS et al., 2009). Em outro estudo, realizado por Takiuchi e colaboradores, foi realizada técnica de PCR semi-nested em 55 amostras de biópsia de fetos abortados coletados de rebanhos bovinos de corte e leite com histórico de problemas de reprodução e a taxa encontrada de infecção por BoHV-1 foi de 25,4% (TAKIUCHI et al., 2005). Em relação as infecções por BVDV no país, Monteiro e colaboradores relatam em seu estudo, após a pesquisa do vírus através da procura de antígenos e da realização da técnica de reverse transcription PCR (RT-PCR) em amostras de 15.584 animais uma prevalência de 42,2% do BVDV-1 e 34,4% do BVDV-2 nos animais do estado do Rio Grande do Sul (MONTEIRO et al., 2019).
Atualmente existem vacinas disponíveis tanto para o BVDV quanto para o BoHV-1; entretanto em ambos os casos a vacinação apresenta desafios únicos inerentes as características dos vírus. Vacinas para o controle do BVDV estão disponíveis desde a década de 60, porém a vacinação como medida única não resultou na eliminação dos casos clínicos relacionados a infecção viral (HOUE; LINDBERG; MOENING, 2006; LINDBERG; HOUE, 2004) – a razão para boa parte do insucesso da vacinação no caso do BVDV se dá em função da heterogeneidade das cepas encontradas em campo do vírus, assim como a capacidade do mesmo de estabelecer infecções persistentes (RIDPATH, 2013).
Ao revisar os efeitos do BoHV-1 na concepção e nas patologias ovarianas nos animais, observou-se que mais de 95% das perdas fetais reprodutivas pelo vírus desde 2009 são resultado do vírus da vacina, colocando à prova a segurança da aplicação de vacinas de vírus vivo modificado nestes casos (CHASE et al., 2017). Já em relação as vacinas inativadas para BoHV-1, estas são capazes de apresentarem uma boa resposta de anticorpos neutralizantes, entretanto eles são indutores fracos de resposta imune mediada por células e a sua resposta de anticorpos produzidos através da vacinação é de curta duração (DESHPANDE et al., 2002).
Levando em consideração a problemática apresentada, a busca por compostos/drogas antivirais que possam ser efetivas é de grande importância. Dentre a classe das proteínas, destaca-se aqui o grupo das lectinas, um grupo heterogêneo de glicoproteínas de origem não imune que apresenta capacidade de se ligar aos carboidratos através dos sítios moleculares com alta afinidade e especificidade. Estas glicoproteínas já foram isoladas de diferentes fontes como plantas, animais, fungos, bactérias e algas (SHARON; LIS, 2004). A especificidade aos carboidratos varia, podendo ser para a manose, ácido siálico, fucose, N-acetilglucosamina, galactose, glicanos complexos e outros (HASSAN et al., 2015; WU et al., 2009.) Lectinas são capazes de reconhecer carboidratos e glicoconjugados tanto em células, quanto em seções de tecidos assim como fluídos biológicos e por isso devem ser consideradas importantes ferramentas a serem estudadas e desenvolvidas na biotecnologia, uma vez que podem vir a ser aplicadas em diagnóstico, aplicações terapêuticas e no desenvolvimento farmacológico (LAM; NG, 2011; NASCIMENTO, 2014; SANTOS et al., 2013).
Dentre as famílias de lectinas encontramos as “Lectinas Relacionadas a Jacalina” (JRL) da qual faz parte a BanLec, lectina extraída do fruto da banana (Musa acuminata) que apresenta especificidade pela manose, assim como pela glicose; com um tamanho de aproximadamente 15 kDa e pode ser observada tanto na forma de dímero, quanto de tetrâmero (HOPPER et al., 2017; MEAGHER et al., 2005; SINGH; DEVI; NG, 2014). Em estudos com modelos animais a lectina da banana demonstrou capacidade de modulação de citocinas pró e anti-inflamatórias, assim como aumento de células TCD4+ e diminuição de células TCD8+ após administração oral, demonstrando seu potencial como imunomoduladora (SANSONE et al., 2016). Frente ao vírus da imunodeficiência humana (HIV), a BanLec demonstrou ser capaz de inibir isolados do vírus independente do tropismo viral e o provável mecanismo de inibição seria o bloqueio da ligação celular ao vírus, assim bloqueando o processo de entrada do HIV (SWANSON et al., 2010). A super expressão da BanLec no tabaco foi capaz de gerar resistência a infecção pelo vírus do mosaico do tabaco tanto in vitro quanto in vivo (LIU; LI; ZHANG, 2014).
A forma H84T da lectina BanLec, onde uma única mutação em um aminoácido na posição 84 de histidina para treonina é altamente eficaz contra diferentes vírus da Influenza aviária, incluindo a cepa pandêmica H1N1 de 1918; e lectina também se demonstrou eficaz in vivo quando administrada via

Metodologia

Para a expressão das proteínas os plasmídeos pAE:BanLec e pAE:Heltuba recombinantes serão inseridos em E. coli BL21 Star (DE3) pela técnica de choque-térmico e cultivados em meio Luria Bertani (LB) sólido com 100 µg.10-1 mL de ampicilina a 37 °C. Uma colônia será selecionada e cultivada em 25 mL de LB líquido com 100 µl.10-1 mL de ampicilina overnight, 37 ºC sob agitação de 180 RPM. Este cultivo será utilizado para inocular 500 mL do mesmo meio, mantido nas mesmas condições. Quando a cultura atingir a fase exponencial de crescimento bacteriano (DO600 = 0,6-0,8), a expressão será induzida pela adição de 500 µL de isopropil βD-tiogalactosídeo (IPTG) a 1 mM, mantendo a cultura nas mesmas condições para expressão da proteína por 3 horas e 30 min.
Após indução, uma alíquota de células será coletada para análise em eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), visando a confirmação da expressão da lectina recombinante. As células em cultivo serão coletadas por centrifugação (10.000 RPM, 40 min, 4 ºC), o pellet lavado com tampão salina-fosfato (PBS) e congelado a -20ºC. As células serão solubilizadas em solução tampão de lise celular (NaH2PO4 20 mM, NaCl 200 mM, Imidazol 20 mM e 1 mM debetamercapto pH 7,4), e rompidas por sonicação (7 ciclos de 15 seg, com 30 seg de intervalo). Em seguida, as amostras serão centrifugadas 10.000 RPM por 60 min a 4 °C.
O sobrenadante contendo a fração de proteínas solúveis será armazenado a 4 ºC e o pellet solubilizado novamente, desta vez no mesmo tampão, acrescido de 6 M de ureia. Após nova centrifugação nas mesmas condições, o sobrenadante contendo a fração solúvel da proteína será separado e armazenado a 4 ºC. Ambas as frações, hidrofílicas e hidrofóbicas serão investigadas por SDS-PAGE, visando identificar a solubilidade da proteína recombinante expressa.
As proteínas recombinantes serão purificadas por cromatografia de afinidade a íons metais (IMAC)/níquel, utilizando coluna His-Trap FF (GE) em Sistema automatizado AKTA-purifier (GE®). Durante a purificação será realizado um processo de redobramento da proteína imobilizada na coluna (refolding), onde a ureia será removida lentamente a partir da geração de um gradiente linear. A faixa de gradiente empregado será de 6 M – 20 mM de ureia. Após remoção da proteína da coluna por eluição com gradiente de imidazol 20 mM – 500 mM, as alíquotas contendo proteína purificada serão combinadas e dialisadas contra PBS e água. A amostra final contendo as proteínas recombinantes purificadas serão liofilizadas para armazenamento. A concentração final da proteína será determinada por teste colorimétrico comercial BCA (Pierce/Thermo Fisher®).
Após a quantificação será feita a análise da proteína recombinante por SDS-PAGE e pela técnica de Western Blot, juntamente com uma alíquota purificada da proteína nativa para comparação. A proteína recombinante será caracterizada através de Western Blot com anticorpo monoclonal anti-cauda de histidina (Sigma®). A proteína purificada será quantificada pelo método de Bradford.
Os ensaios eletroforéticos unidimensionais em gel de poliacrilamida (nas condições: nativa e desnaturante) serão realizados de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970), adaptada para uso de placas. As bandas proteicas serão coradas com Coomassie Brilliant Blue R-250 a 0,05 %, preparado em uma solução de metanol:ácido acético:água (1:3,5:8, v/v/v) ou reveladas com nitrato de prata. As amostras serão eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose. Esta membrana será bloqueada com leite em pó 5% por 1h em temperatura de 28°C, e incubada por mais 1h utilizando como anticorpo primário o anti-rBanLec-like policlonal de rato (1:3000), depois a membrana será lavada 3 vezes com PBS-T (1L de PBS com 500µl de TWEEN 20%) e 1 vez com água destilada, preparando a membrana para uma nova incubação de 1h com o anticorpo secundário anti-rato (1:6000). Posteriormente será feita uma nova lavagem na membrana e a revelação feita pelo método colorimétrico, pela incubação da membrana com um substrato que reage com a enzima reveladora peroxidade que é ligada ao anticorpo secundário. Um segundo SDS-PAGE será realizado para visualização das amostras coradas por azul de Coomassie. A lectina Heltuba será detectada da mesma forma utilizando-se anticorpo específico.
Meio Essencial Mínimo com sais de Eagle (E-MEM, Sigma-Aldrich®, USA) suplementado com antibióticos penicilina (Sigma-Aldrich®, USA), estreptomicina (Vetec®, Brasil), enrofloxacina (Bayer®, Brasil) e anfotericina B (Cristália®, Brasil), será utilizado em todas as etapas que envolverão a utilização de células. Nas etapas que necessitam de crescimento celular o E-MEM será ainda suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Gibco, Grand Island, NY). Para a utilização das lectinas, essas serão diluídas em E-MEM e estocadas a -20 ºC na concentração 1 mg.mL-1 até momento do uso. Para as demais diluições será utilizado E-MEM.
Células da linhagem MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) serão utilizadas por serem suscetíveis aos vírus estudados. As células serão provenientes do banco de células do Laboratório de Virologia e Imunologia da Faculdade de Veterinária, UFPel (LabVir). As células serão cultivadas em E-MEM suplementado com 10% de SFB em garrafas de cultivo celular em estufa com temperatura 37 ºC. Para os ensaios de citotoxicidade, ensaios antivirais e titulações virais, as células serão removidas da garrafa pelo processo de tripsinização (descolamento e individualização das células por processo enzimático pela tripsina) e cultivadas em placas de 96 cavidades (KASVI ®, Brasil) em estufa úmida a 37 ºC com 5% de CO2, até estabelecimento de monocamada celular (aproximadamente 1 x 107 células / ml) por poço.
Os vírus serão obtidos junto ao banco de vírus do LabVir - UFPel. Os vírus, estocados em criotubos em botijões com nitrogênio líquido, possuem títulos conhecidos (informação necessária para diluições virais em ensaios futuros). Quando na necessidade de conhecer o título viral após ensaios antivirais e/ou virucidas, as titulações serão realizadas segundo o método previamente estabelecido (REED; MUENCH, 1938).
Para os ensaios de citotoxicidade as células MDBK serão cultivadas em placas de 96 cavidades por 24 horas em estufa úmida a 37 ºC com 5% DE CO2 e expostas à diferentes concentrações das lectinas. Os testes serão realizados em duplicata e incubados por 24 horas sob as mesmas condições até o momento da leitura. Como controles serão utilizadas células mantidas em E-MEM, sem nenhum tipo de exposição às proteínas. Após essas etapas, as placas serão submetidas ao ensaio de redução do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl) -2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo) segundo MOSMANN, (1983), técnica baseada na clivagem, por mitocôndrias ativas nas células, dos sais de tetrazólio, transformando-se de um composto de coloração amarela em um composto de coloração azul escuro/roxo escuro, chamado de formazan (cristais insolúveis em soluções aquosas).
O meio será aspirado e 50 µL de MTT será colocado em cada poço da placa posteriormente incubada de 3-4 h em condições ideais de CO2 e temperatura. Em seguida retira-se o excesso de MTT, delicadamente para não retirar os cristais no fundo do poço, e é adicionado 100 µl DMSO para dissolver os cristais. Após alguns minutos em temperatura ambiente, para se ter certeza de que todos os cristais serão dissolvidos, a placa será lida usando leitor de Elisa Microplate reader MR-96 (Mindray) ®, sob comprimento de onda de 545 nm. Os percentuais de viabilidade celular (VC) serão calculados segundo a fórmula: VC= AT/AC x 100, onde AT e AC significam a absorbância das células tratadas e do controle de células, respectivamente e, dessa forma será obtida a concentração inibitória para 50% do cultivo celular (CI50%).
Para determinar o título viral, será utilizado o método de Reed & Müench (1938). Resumidamente, os vírus serão submetidos às diluições seriadas na base 10 e 25 µL de cada diluição será transferida para poços de placas de 96 cavidades em quadruplicata. Após, as suspensões celulares serão colocadas juntamente com os vírus. Depois de 72 horas de incubação as placas serão analisadas em microscópio invertido. Todos os poços serão avaliados para verificação da integridade celular e analisados através da fórmula de REED; MUENCH (1938) e assim o título viral será determinado.
Os títulos serão expressos como doses infectantes para 50% de cultivos celulares (DICC50/25 µL). Para obtenção dos percentuais de inibição viral (PI) será aplicada a fórmula:
Para este ensaio, as células MDBK serão previamente cultivadas em placas de 96 cavidades em temperatura de 37°C em ambiente com 5% de CO2, por 24 horas. No momento da infecção das células com os vírus, será utilizada a concentração viral de 0,1 MOI (multiplicity of infection). As concentrações das proteínas serão baseadas no ensaio de citotoxicidade, realizado em etapa prévia. A atividade antiviral será avaliada através de dois métodos distintos: através da viabilidade celular e do título viral, após: 1) tratamento das células com as proteínas nativas ou recombinantes antes da infecção e 2) tratamento das células após a infecção. Todas as análises serão realizadas em quadruplicata.
No experimento para determinar a atividade das lectinas sobre as células antes da infecção do vírus, as células MDBK serão incubadas com 100 µL de cada um dos tratamentos, e após 2 horas, o sobrenadante será cuidadosamente aspirado e os vírus adicionados (100 µL. poço-1, 0,1 MOI). Após 72 horas de incubação as placas serão lidas (Redução do MTT e titulação viral). As placas destinadas à realização da titulação viral serão congeladas e descongeladas para rompimento celular. Já no tratamento após infecção, as células serão previamente cultivadas e submetidas à infecção viral (100 µL. poço-1 , 0,1 MOI) e após 2 horas, o sobrenadante será aspirado e os tratamentos serão aplicados sobre as células (100 µL. poço-1 ). Após 72 horas a leitura

Indicadores, Metas e Resultados

Indicadores:
- Expressar e purificar lectinas a partir de construções sintéticas;
- Testar a atividade antiviral e virucida das lectinas da família das Jacalinas;
- Determinar as concentrações tóxicas das proteínas frente as células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK);
- Determinar as concentrações de lectinas com ação antiviral e virucida sobre os vírus BVDV e BoHV-1;
- Analisar o mecanismo de ação antiviral das lectinas antes e após a infecção.
Metas:
- Construir no primeiro ano dois vetores para a expressão de lectinas da família da jacalinas;
- Testar no segundo ano uma das lectinas recombinantes expressa a partir das construções e determinar sua atividade virucida ou antiviral;
- Testar no terceiro ano a segunda lectina em sua forma recombinante e determinar sua atividade virucida ou antiviral;
- Determinar no quarto ano o mecanismo de ação das lectinas em células MDBK.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ALICE CALDERIPE DE LIMA
CAMILA GARCIA DE SOUZA
DANILLO DE OLIVEIRA DELLA SENTA
GEFERSON FISCHER1
GUILHERME FEIJÓ DE SOUSA
LUCIANO DA SILVA PINTO5
PAULO RICARDO CENTENO RODRIGUES8

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