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Tendo em mente a biodiversidade encontrada dentro do Bioma Pampa e a presença de plantas infestantes presentes em sua vegetação, além da possibilidade de hospedeiros alternativos servirem como fonte de inóculo para novas doenças em culturas de importância econômica e vice-versa, este projeto justifica-se
por obter dados acerca da presença de begomovírus presentes em plantas infestantes do Bioma Pampa. Esta informação será importante para verificar se estas espécies futuramente podem se transferir para as plantas de culturas de interesse econômico, visto que a mosca branca é uma praga que vem se disseminando cada dia mais.

7.1. Detecção de isolados virais
As amostras de plantas com importância agrícola do Bioma Pampa, apresentando sintomas típicos de infecção por begomovírus e/ou plantas assintomáticas, coletadas no sudeste do Rio Grande do Sul, terão seu DNA extraído através do método de extração de DNA total de tecidos vegetais de Doyle & Doyle (1987). Após extraído, o DNA total será submetido à amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador, juntamente com o par universal de primers ‘PAL1v1978’ e ‘PAR1c496’ utilizados para detecção de begomovírus (ROJAS et al., 1993). O produto da reação será lido utilizando o método de eletroforese em gel de agarose 1% com leitura em transluminador UV. Fragmentos que resultarem no tamanho de 1100pb, serão clonados com o vetor pGEM-T-EASY (Promega), de acordo com as instruções do fabricante, e posteriormente os clones gerados enviados para sequenciamento.

7.2. Análises de sequências dos isolados
As sequências obtidas irão ser lançadas no programa BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) com a finalidade de comparar suas identidades com os demais isolados virais disponíveis no banco de dados. Mediante o resultado da comparação, caso haja sequências que possuam identidade inferior a 91% (DUARTE, M. F. 2019) com as demais espécies de begomovírus estas então serão selecionadas para terem seu genoma completo clonado.

7.3. Clonagem e sequenciamento dos genomas virais completos
Visando-se amplificar o genoma inteiro dos isolados obtidos, aqueles isolados que apresentarem resultado positivo no PCR, irão ser utilizados para reação de amplificação por RCA (Rolling Circle Amplification), juntamente com a enzima DNA polimerase do bacteriófago phi 29 do kit Templiphi (GE Healthcare), de acordo com o método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). O DNA amplificado será submetido a reações de clivagem com diferentes enzimas de restrição. O produto destas reações será analisado em gel de agarose 0,7% corado em GELRed. Alíquotas das reações de clivagem com fragmentos de 2600 nucleotídeos (nt), que corresponde a uma cópia de cada componente genômico, serão expostas a reação de ligação no vetor pBluescript KS+ (Stratagene) que será previamente linearizado com a respectiva enzima utilizada e defosforilado. O produto da reação de ligação irá então ser usado para transformação de E. coli estirpe DH5α utilizando o método de choque térmico de Sambrook & Russel (2001). As colônias então serão repicadas para meio LB líquido e incubadas a 37C durante 12 horas. Após a incubação, as colônias serão submetidas à minipreparação de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina (SAMBROOK & RUSSEL, 2001) sendo que o DNA resultante será analisado em gel de agarose 0,7% corado em brometo de etídeo. As amostras de DNA plasmidial cujo comprimento for de ~ 5500 nt, que corresponde ao vetor plasmidial ligado ao genoma viral, serão submetidas novamente a reação de clivagem com a mesma enzima usada na clonagem, e o resultado será analisado em gel de agarose 0,7%. Agora as amostras com comprimento de 2600 nt, que corresponde ao genoma inteiro do isolado, serão selecionadas e enviadas para terem seu genoma inteiro sequenciado (macrogen).

Como metas e resultados espera-se Identificar e caracterizar possível(is) nova(s) espécie(s) e/ou espécie(s) de begomovírus que ainda não havia(m) sido relatada(s) nesta região. Além de obter sequência(s) completa(s) do(s) genoma(s) do(s) isolado(s) diagnosticado(s) com begomovírus. Espera-se que se estas metas forem alcançadas possa-se monitorar a gama de hospedeiros e a disseminação destes vírus no Estado.