Nome do Projeto
Levantamento de espécies do gênero Begomovirus em amostras de plantas infestantes associadas à culturas de importância agrícola cultivadas no Bioma Pampa.
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
04/08/2022 - 29/03/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
As begomoviroses vêm se tornando uma ameaça à produção de culturas como o algodão, milho, tomate e mandioca, principalmente em regiões tropicais e subtropicais. As espécies virais causadoras destas doenças pertencem ao gênero Begomovirus da família Geminiviridae. Caracterizam-se por ter genoma composto por ssDNA e por serem transmitidaspela mosca-branca (Bemisia tabici Hemiptera: Aleyrodidae). O sucesso na sua emergência como patógenos é atrelado em parte à plasticidade dos seus genomas, e em parte pelo hábito polífago do seu vetor. Tendo em mente, principalmente, estas duas características o objetivo do projeto é diagnosticar a presença deste(s) patógeno(s) e caracterizar a sequência completa de seu(s) genoma(s) em amostras de plantas infestantes, coletadas em áreas do Bioma Pampa. Amostras foliares, terão seu DNA total extraído que será utilizado inicialmente em uma PCR (“Polymerase Chain Reaction”) utilizando primers específicos para begomovirus com o intuito de rastrear amostras infectadas. A seguir, as amostras positivas no PCR serão selecionadas para prosseguir com a amplificação via técnica de RCA (“Rolling Circle Amplification”), análise com enzimas de restrição, e clonagem das sequências do genoma completo. Desta forma, o projeto visa fornecer informações acerca do genoma completde espécies virais que estão presentes em plantas infestantes associadas a culturas de importância econômica cultivadas no Bioma Pampa, alertando para uma possível transferência de begomoviroses de plantas não-cultivadas para cultivadas e também monitorar a disseminação e a gama de hospedeiros destes vírus no Rio Grande do Sul.

Objetivo Geral

Este projeto tem por objetivo geral diagnosticar e obter sequência(s) completa(s) do(s) genoma(s) de begomovírus encontrados infectando amostras de plantas infestantes associadas a culturas de importância econômica.

Justificativa

Tendo em mente a biodiversidade encontrada dentro do Bioma Pampa e a presença de plantas infestantes presentes em sua vegetação, além da possibilidade de hospedeiros alternativos servirem como fonte de inóculo para novas doenças em culturas de importância econômica e vice-versa, este projeto justifica-se
por obter dados acerca da presença de begomovírus presentes em plantas infestantes do Bioma Pampa. Esta informação será importante para verificar se estas espécies futuramente podem se transferir para as plantas de culturas de interesse econômico, visto que a mosca branca é uma praga que vem se disseminando cada dia mais.

Metodologia

7.1. Detecção de isolados virais
As amostras de plantas com importância agrícola do Bioma Pampa, apresentando sintomas típicos de infecção por begomovírus e/ou plantas assintomáticas, coletadas no sudeste do Rio Grande do Sul, terão seu DNA extraído através do método de extração de DNA total de tecidos vegetais de Doyle & Doyle (1987). Após extraído, o DNA total será submetido à amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador, juntamente com o par universal de primers ‘PAL1v1978’ e ‘PAR1c496’ utilizados para detecção de begomovírus (ROJAS et al., 1993). O produto da reação será lido utilizando o método de eletroforese em gel de agarose 1% com leitura em transluminador UV. Fragmentos que resultarem no tamanho de 1100pb, serão clonados com o vetor pGEM-T-EASY (Promega), de acordo com as instruções do fabricante, e posteriormente os clones gerados enviados para sequenciamento.

7.2. Análises de sequências dos isolados
As sequências obtidas irão ser lançadas no programa BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) com a finalidade de comparar suas identidades com os demais isolados virais disponíveis no banco de dados. Mediante o resultado da comparação, caso haja sequências que possuam identidade inferior a 91% (DUARTE, M. F. 2019) com as demais espécies de begomovírus estas então serão selecionadas para terem seu genoma completo clonado.

7.3. Clonagem e sequenciamento dos genomas virais completos
Visando-se amplificar o genoma inteiro dos isolados obtidos, aqueles isolados que apresentarem resultado positivo no PCR, irão ser utilizados para reação de amplificação por RCA (Rolling Circle Amplification), juntamente com a enzima DNA polimerase do bacteriófago phi 29 do kit Templiphi (GE Healthcare), de acordo com o método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). O DNA amplificado será submetido a reações de clivagem com diferentes enzimas de restrição. O produto destas reações será analisado em gel de agarose 0,7% corado em GELRed. Alíquotas das reações de clivagem com fragmentos de 2600 nucleotídeos (nt), que corresponde a uma cópia de cada componente genômico, serão expostas a reação de ligação no vetor pBluescript KS+ (Stratagene) que será previamente linearizado com a respectiva enzima utilizada e defosforilado. O produto da reação de ligação irá então ser usado para transformação de E. coli estirpe DH5α utilizando o método de choque térmico de Sambrook & Russel (2001). As colônias então serão repicadas para meio LB líquido e incubadas a 37C durante 12 horas. Após a incubação, as colônias serão submetidas à minipreparação de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina (SAMBROOK & RUSSEL, 2001) sendo que o DNA resultante será analisado em gel de agarose 0,7% corado em brometo de etídeo. As amostras de DNA plasmidial cujo comprimento for de ~ 5500 nt, que corresponde ao vetor plasmidial ligado ao genoma viral, serão submetidas novamente a reação de clivagem com a mesma enzima usada na clonagem, e o resultado será analisado em gel de agarose 0,7%. Agora as amostras com comprimento de 2600 nt, que corresponde ao genoma inteiro do isolado, serão selecionadas e enviadas para terem seu genoma inteiro sequenciado (macrogen).

Indicadores, Metas e Resultados

Como metas e resultados espera-se Identificar e caracterizar possível(is) nova(s) espécie(s) e/ou espécie(s) de begomovírus que ainda não havia(m) sido relatada(s) nesta região. Além de obter sequência(s) completa(s) do(s) genoma(s) do(s) isolado(s) diagnosticado(s) com begomovírus. Espera-se que se estas metas forem alcançadas possa-se monitorar a gama de hospedeiros e a disseminação destes vírus no Estado.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
DANIELLE RIBEIRO DE BARROS2
VICTOR CHIM ISER

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