Nome do Projeto
Diagnóstico molecular de Toxoplasma gondii em produtos de origem animal, produzidos de forma artesanal, em estabelecimentos da região sul do Rio Grande do Sul
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/09/2022 - 29/12/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório de distribuição cosmopolita. Os felídeos são os hospedeiros definitivos, enquanto o homem, outros mamíferos e aves são hospedeiros intermediários. Na Saúde Pública, T. gondii possui importância por causar graves desordens fetais e neonatais em humanos, além de prejuízos à saúde de crianças, idosos e adultos imunocomprometidos. A transmissão alimentar de T. gondii é uma importante via de infecção e o consumo de carne malcozida/crua é conhecido por ser um fator de risco significativo, bem como os laticínios que podem representar risco à saúde do consumidor, principalmente quando oriundo de leite cru, não pasteurizado, podendo afetar a saúde de crianças, idosos e pessoas imunocomprometidas que integram o leite e derivados a sua dieta alimentar de rotina. Sendo assim se faz importante investigar a presença de T. gondii em queijos e salames produzidos de forma artesanal e comercializados em feiras livres do município de Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. Para tanto, serão colhidas alíquotas de queijo e salame colonial adquiridos em feiras livres do município de Pelotas. Para a detecção de T. gondii será realizada a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). As amostras serão processadas pelo método preconizado pelo Ministério da Saúde para investigação de T. gondii em amostras alimentares. Os resultados obtidos serão analisados e dados serão avaliados pelo programa EPI INFO (Versão 3.5.1, Center for Disease Control, Atlanta, USA) utilizando o teste de Qui-quadrado (χ2). Serão considerados estatisticamente significativos os valores de p<0,05. Os resultados obtidos através deste estudo posteriormente serão encaminhados para publicação em congressos nacionais e internacionais da área e publicação em periódicos científicos.

Objetivo Geral

Investigar a presença de T. gondii em queijos e salames produzidos de forma artesanal e comercializados em feiras livres do município de Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.

Justificativa

Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório de distribuição cosmopolita. Os felídeos são os hospedeiros definitivos, enquanto o homem, outros mamíferos e aves são hospedeiros intermediários (HILL & DUBEY, 2002). Na Saúde Pública, T. gondii possui importância por causar graves desordens fetais e neonatais em humanos, além de prejuízos à saúde de crianças, idosos e adultos imunocomprometidos (PINTO et al., 2009). A transmissão da toxoplasmose pode se dar verticalmente para o feto através da placenta; ou horizontalmente, por meio da ingestão de oocistos esporulados em alimentos e água, de cistos teciduais presentes em carnes cruas/malcozidas ou de subprodutos cárneos, e de taquizoítos em leite e queijo cru (COSTA et al., 2020). Embora a rota de transmissão de T. gondii seja variável, a maioria dos casos de toxoplasmose humana é atribuída ao consumo de alimentos e água infectados (OSSANI et al., 2017); sendo hábitos culinários, fatores culturais e ambientais de grande importância na epidemiologia da infecção (KOLBEKOVA et al., 2007).
A transmissão alimentar de T. gondii é uma importante via de infecção e o consumo de carne malcozida/crua é conhecido por ser um fator de risco significativo (BELLUCO et al., 2018). Em estudo conduzido na região sul do Rio Grande do Sul, 99,1% das pessoas entrevistadas consumiam algum tipo de carne. A prevalência de consumo foi semelhante entre carnes vermelhas (99,3%) e brancas (99,4%), entretanto os embutidos, consumidos por 85,5% das pessoas, apresentaram a maior prevalência de consumo diário (16,6%) (SCHNEIDER et al., 2014). Nesta região, a elevada soroprevalência para T. gondii (75,1%), foi relacionada com os hábitos de consumir embutidos artesanais típicos à base de carne defumada, provar o tempero da carne crua durante seu preparo e manusear carne crua (CARVALHO, 2014). Além disso, indivíduos que ingeriram carne suína, bovina ou de frango apresentaram maiores títulos de anticorpos anti-T gondii (ARAÚJO et al., 2018). A infecção por cistos presentes na carne crua ou malcozida, incluindo embutidos, são considerados a via predominante da infecção humana (FREYRE et al.,2008; MILLER et al.; 2009). Entretanto, ainda são escassos os estudos de investigação de T. gondii em embutidos cárneos no sul do Rio Grande do Sul.
Tradicionalmente, os produtos coloniais de origem animal, como salames e queijos, são apreciados pela população do estado do Rio Grande do Sul. O amplo consumo se dá devido a apreciação de seu sabor e em apoio a economia local (AMBROSINI et al., 2020). A produção de queijos é uma alternativa para aumentar a renda de pequenos produtores, sendo que a maior parte desse produto é produzido e comercializado de maneira informal nas feiras livres do município, especialmente devido as dificuldades de adequação à legislação sanitária, ambiental e tributária (GUIMARÃES & PINHEIRO, 2018). No entanto, esses produtos podem carrear patógenos responsáveis por causar doenças transmitidas por alimentos (DTAs) quando produzidos sem adequada inspeção sanitária. Além disso, a ocorrência de microrganismos patogênicos e deterioradores em números que excedem aos limites estabelecidos pela legislação já foi descrita em queijos coloniais da região sul do Rio Grande do Sul (TAVARES et al., 2019).
Os laticínios podem representar risco à saúde do consumidor, principalmente quando oriundo de leite cru, não pasteurizado, podendo afetar a saúde de crianças, idosos e pessoas imunocomprometidas que integram o leite e derivados a sua dieta alimentar de rotina (MEDEIROS, 2019). Nos últimos anos, a ingestão de leite de animais foi descrita como uma via de transmissão da toxoplasmose para humanos (RANUCCI et al., 2020). A presença de T. gondii já foi relatada em laticínios no Brasil (OSSANI et al., 2017), inclusive relacionando o consumo de queijo à ocorrência de surtos de toxoplasmose (COSTA et al., 2020).
Atualmente, o Brasil possui incidências de toxoplasmose que estão entre as mais altas descritas na literatura (BRASIL, 2020), e a vigilância epidemiológica específica para esta doença está em fase de estruturação. A indisponibilidade ou fragilidade da informação prejudica a análise da situação de saúde e a tomada de decisões baseadas em evidências (BRASIL, 2020). A investigação e o diagnóstico deste parasito podem contribuir para a tomada de medidas de prevenção e controle da toxoplasmose, além da intervenção terapêutica adequada e consequente redução de complicações, sequelas e óbitos (BRASIL, 2018). Para tanto, diversos testes laboratoriais podem ser empregados, como a detecção sorológica, cultura de células, bioensaios e métodos moleculares (SWITAJ et al., 2005). Dentre estes, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) demonstra maior precisão, sensibilidade e especificidade quando comparada a métodos tradicionais de diagnóstico da toxoplasmose (DEHKORDI et al., 2013). Assim, este método pode auxiliar a investigação de questões relativas à ocorrência de T. gondii em produtos coloniais na região sul do Rio Grande do Sul.

Metodologia

Amostragem e coleta das amostras
Para a execução do projeto será utilizada uma amostragem por conveniência. Para isso, serão colhidas alíquotas de queijo e salame colonial adquiridos em feiras livres do município de Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. Após levantamento realizado em conjunto com veterinários e técnicos do Serviço de Inspeção Municipal (SIM), constatou-se que 20 feirantes comercializam salame e/ou queijo colonial nas 40 feiras livres do município. Uma amostra dos produtos será colhida nas bancas de cada feirante, uma única vez.

Diagnóstico de T. gondii
Para a detecção de T. gondii será realizada a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). As amostras serão processadas pelo método preconizado pelo Ministério da Saúde para investigação de T. gondii em amostras alimentares (BRASIL, 2020).

Processamento das amostras de salame
Será obtido 50g de carne procedente dos embutidos cárneos coletados. As peças obtidas serão acondicionadas em sacos de primeiro uso e vedados com fita adesiva. Posteriormente, serão submetidas à técnica de digestão péptica.

Digestão péptica
Para ruptura dos cistos de T. gondii da massa muscular e liberação dos bradizoítas em solução salina, é realizada a técnica de digestão péptica. Esta técnica replica in vitro o processo de digestão gástrica que ocorre naturalmente nos indivíduos no momento da infecção para a liberação dos bradizoítas, para que possam invadir os enterócitos.

Processamento das amostras de queijo
Com auxílio de pinças e bisturis, o queijo será cortado em fatias. Em uma embalagem de primeiro uso, 25g da amostra colhida de vários pontos (superfície e profundidade) será acondicionado. Posteriormente, 225mL de Tween-80 a 0,1% será adicionado, a amostra será macerada manualmente por 2 minutos. A suspensão será filtrada em gaze dupla e transferida para tubos de centrifugação de fundo cônico de 50mL. A centrifugação será feita a 2.100x g por 10 minutos. O sobrenadante será descartado cuidadosamente com auxílio da pipeta Pasteur até restar o volume mínimo necessário para ressuspender o sedimento. O sedimento será aliquotado em microtubo e armazenado a 4°C até a detecção.

Extração e purificação de ácido desoxirribonucleico – DNA
A extração de DNA será realizada usando o Nucleospin Tissue® Kit comercial Macherey-Nagel, de acordo com as recomendações do fabricante. Os produtos de extração serão armazenados a -20°C até a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Reação em Cadeia da Polimerase – PCR
Para a detecção de T. gondii, será utilizado como alvo o fragmento não codificante de 529 pb repetido no genoma do parasito, usando primers descrito por HOMAN et al. (2000). Os produtos de PCR serão visualizados após eletroforese em gel de agarose a 1,5% corada com SyBr Safe DNA (Invitrogen®). Serão consideradas positivas as amostras que apresentarem uma massa de DNA com 529 pb.

Análise estatística
Os resultados obtidos serão analisados e dados serão avaliados pelo programa EPI INFO (Versão 3.5.1, Center for Disease Control, Atlanta, USA) utilizando o teste de Qui-quadrado (χ2). Serão considerados estatisticamente significativos os valores de p<0,05.

Indicadores, Metas e Resultados

Por meio deste estudo, pretende-se investigar a presença de T. gondii em produtos coloniais e averiguar se estes representam risco à saúde humana. Em caso de positividade, a investigação será ampliada em conjunto com a equipe do SIM, buscando encontrar os rebanhos positivos. A partir disso, estimular os produtores a se adequarem as boas práticas de fabricação de queijos e embutidos cárneos, através de palestras e cursos.
Durante a execução do projeto, acadêmicos de graduação participarão das atividades, garantindo o treinamento na realização das técnicas e no acúmulo teórico. Os resultados obtidos através deste estudo posteriormente serão encaminhados para publicação em congressos nacionais e internacionais da área e publicação em periódicos científicos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
BRUNA ROCHA TEIXEIRA
DIEGO MOSCARELLI PINTO1
EVERTON FAGONDE DA SILVA2
FELIPE GERALDO PAPPEN1
JERONIMO LOPES RUAS2
JULIA SOMAVILLA LIGNON
JULIA VICTORIA SANTOS DE SOUZA
LAURA RAFAELA BAUMGARTEN
MARIA EDUARDA RODRIGUES
MARIA GABRIELA CUSTODIO KOBAYASHI
NATÁLIA SOARES MARTINS
RODRIGO CASQUERO CUNHA2
VITORIA DE CARVALHO OSCAR
YASMIN SCHNEIDER MORGADO
ÂNGELA LEITZKE CABANA

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