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São considerados probióticos os microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas conferem benefícios a saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Já foram descritos benefícios nos parâmetros produtivos em animais de produção que receberam suplementação nutricional com microrganismos probióticos como aumento da produção de leite, maior ganho de peso e conversão alimentar (ANTUNOVIĆ et al., 2005; KRITAS et al., 2006). Além de atuarem no rendimento de produtividade animal, também estão relacionados com a modulação da resposta imune (ROOS et al., 2010). Estudos demonstram o potencial probiótico como imunomoduladores, através do aumento na atividade de macrófagos e de células natural killer (DE MORENO DE LEBLANC et al., 2008) e nos níveis de imunoglobulinas e produção de citocinas (SANTOS et al., 2018). Os probióticos modulam a inflamação induzida por patógenos por meio de vias de sinalização reguladas por receptores de Toll-like (YAN; POLK, 2011). Em geral, para que os probióticos possam exercer todos os seus efeitos benéficos, há necessidade de uma suplementação continua (de Moreno de LeBlanc et al., 2008). No entanto, Santos e colaboradores (2018) demonstram que com apenas 7 dias de suplementação com Bacillus toyonensis BCT-7112T, camundongos imunizados com vacina recombinante já apresentam efeitos imunomodulatórios.
Na suinocultura o uso de probióticos vem sendo sugerido como alternativa ao uso de antibióticos em casos de diarreia pós-desmame, além de serem utilizados como promotores de crescimento (DȨBSKI, 2016; SHIN et al., 2019). Estudos evidenciaram que o uso de probióticos em leitões desmamados promoveu um aumento da diversidade bacteriana e consequente estabilização da microbiota intestinal (LIU et al., 2015). Os Lactobacillus bem como seus metabólitos apresentam potencial de controlar patógenos como Escherichia coli e Salmonella typhimurium que causam diarreia em suínos após o desmame (WANG et al., 2011; ZHANG et al., 2010), promovendo o crescimento e a melhora da qualidade da carne (SUO et al., 2012). Em estudos anteriores, nosso grupo de pesquisa observou que camundongos suplementados por 72 horas com Lacticaseibacillus casei P054 demostraram aumento nos níveis de IgG
total frente a uma vacina vírica, quando comparado a animais que não receberam suplementação (dados não publicados).

Dentre as doenças que acometem os suínos e causam grandes prejuízos econômicos ao setor, está a Enteropatia Proliferativa (EP). A EP pode se manifestar na forma aguda, caracterizada por diarreia sanguinolenta e rápido óbito dos animais (MCORIST et al., 1995; VANNUCCI; GEBHART, 2014) ou ainda na forma crônica (subclínica), caracterizada principalmente pela diminuição do crescimento do suíno e aumento da frequência de natimortos (GUEDES et al., 2017; MCORIST et al., 1995). Trata-se de uma doença infecciosa causada pela bactéria intracelular Lawsonia intracellularis, a qual apresenta distribuição global e prevalência de 57 a 100% em todo o mundo (McORIST et al., 2003). Estima-se que a EP cause uma perda econômica de 100 € (R$ 601,00, 1€ = 6,01 R$, cotação dia 03/02/2022) por animal reprodutor afetado, além da perda de pelo menos US $ 1.531 (R$ 8.129,00, 1 US $ = 5,31 R$, cotação dia 03/02/2022) por suíno de corte afetado (JENSEN; CHRISTENSEN; BOYE, 2006). A vacinação contra L. intracellularis é a medida profilática mais eficiente e promissora para o controle da doença, contudo as vacinas atualmente disponíveis são baseadas na bacterina ou em células vivas atenuadas de L. intracellularis, as quais exigem cultivo em larga escala em culturas celulares em suspensão, tornando a sua produção onerosa. Em alguns casos, como em suínos alojados em sistemas com cama, a vacina atenuada não estimulou resposta imune eficaz (HOLYOAKE et al., 2009), falhas na indução de imunidade esterilizante foram observadas e geralmente são necessárias intervenções adicionais para controlar a doença (KRUSE et al., 2017; RIBER et al.,
2015). A suplementação alimentar de suínos com probióticos é capaz de reduzir as taxas de eliminação de L. intracellularis nas fezes, além de aumentar a diversidade da microbiota do íleo, levando a uma mitigação dos sintomas da infecção (MUWONGE; KARUPPANNAN; OPRIESSNIG, 2021; OPRIESSNIG et al., 2019).
A grande maioria das vacinas desenvolvidas e utilizadas atualmente apresentam administração parenteral (ex. intramuscular ou subcutâneo) induzindo uma resposta imune sistêmica, mas insuficiente em nível de mucosas. Entretanto, antígenos vacinais apresentados por via das mucosas podem induzir uma resposta local, bem como uma resposta imune sistêmica (MCGHEE et al., 1992; XU-AMANO et al., 1994). O desenvolvimento de vacinas as quais os antígenos possam a ser apresentado ao sistema imune via mucosas auxilia de forma significativa no controle da doença, na segurança de sua aplicação, bem como na indução de uma resposta imune sistêmica específica. Uma estratégia para a apresentação de antígenos por esta via é o uso de bactérias vivas como sistema de entrega. Bactérias comensais, probióticas e também patogênicas atenuadas tem sido exploradas para este propósito (BAKER, 2005; ROLAND et al., 2005; SHONYELA et al., 2021). Há várias espécies bacterianas que podem ser utilizados como vetores vivos utilizados na entrega de proteínas heterólogas, podendo ser utilizadas como vacinas orais (TROMBERT, 2015). Dentre elas, estão as bactérias ácido láticas (BAL), por exemplo, que são capazes de induzir respostas imunes de mucosa (IgA) e sistêmica (IgG) (BERMÚDEZ-HUMARÁN et al., 2011), além de apresentar como vantagem: facilidade de cultivo; manipulação genética simples, reprodutível e eficiente; segurança do sistema de expressão de grau alimentício para administração oral; sistema promotor regulável; induzem resposta de longa duração; a proteína expressa pode ser administrada juntamente com as demais proteínas, sem necessidade de purificação (SHONYELA et al., 2021).
Estudos de vacinologia reversa, realizados pelo nosso grupo de pesquisa, visando selecionar o antígeno ideal para o desenvolvimento de uma vacina contra EP destacam uma proteína (Li) conservada em todas as cepas de L. intracellularis, a qual apresenta 98% de similaridade do gene 16S-rDNA da cepa de suíno com as outras estirpes. Esta proteína é reconhecida pelo soro de suínos infectados, o que sugere uma expressão consistente pela bactéria L. intracellularis e indica que esta proteína
apresenta a capacidade de ativar o sistema imune hospedeiro (WATSON et al., 2014). Nosso grupo já vem trabalhando com esta proteína (rLi) fusionada à molécula da toxina tetânica (TT), denominada rLiTT, a qual foi expressa em E. coli, purificada, quantificada e adsorvida no adjuvante hidróxido de alumínio. A construção vacinal baseada em rLiTT foi avaliada em camundongos (100 μg, nos dias 0 e 21) e suínos (400 μg, nos dias 0 e 21). Os animais vacinados apresentaram níveis significativos de anticorpos específicos à rLiTT, demonstrando o potencial vacinal do alvo selecionado.

Visto isso, esse projeto visa desenvolver uma vacina composta por antígenos recombinantes de L. intracellularis selecionados por vacinologia reversa, utilizando como sistema de expressão e entrega o microrganismo probiótico recombinante Lacticaseibacillus casei, para proteger suínos contra Enteropatia Proliferativa.

Produção do probiótico
L. casei P054, anteriormente isolado e caracterizado pelo grupo de pesquisa (SAALFELD et al., 2013) será semeado em meio MRS (de Man Rogosa & Sharpe) e incubado a 37 °C durante 24 horas. Após o crescimento de colônias isoladas, serão inoculadas 3-5 colônias em Erlenmeyer de 500 mL, contendo 100 mL de meio MRS, e incubados em agitador orbital a 100 rpm, permanecendo a 37 °C por 24 horas. Esses servirão de inóculo para cultivo em agitador orbital contendo 3 frascos com 500 mL de meio MRS cada. A agitação será mantida a 100 rpm e a temperatura a 37 °C durante 24 horas, sem correções de pH durante o processo.
Construção vacinal (LC-Li)
O plasmídeo sintético pVE5523 contendo a sequência dos antígenos de L. intracellularis, selecionados através de vacinologia reversa, serão usados para transformar, através de eletroporação, células de L. casei. Após o processo de transformação as células de L. casei recombinantes (LC-Li) serão selecionadas em meio MRS sólido contendo ampicilina incubados a 37 °C por 72 horas em condições de anaerobiose.
Avaliação da expressão dos antígenos recombinantes (rLi)
Para a análise da expressão do antígeno rLi, os microrganismos transformados e não transformados serão cultivados em meio específicos de crescimento. As células bacterianas serão lisadas e o perfil de proteínas será analisado pela técnica de SDS-PAGE 10%. A confirmação da expressão será realizada através da técnica de Western Blot. Brevemente, as proteínas serão transferidas do gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose. Será adicionada à membrana uma solução contendo o anticorpo policlonal anti-rLi produzido em camundongo. Posteriormente, anticorpos polivalentes de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich) serão adicionados à membrana. Todas as reações dos anticorpos serão realizadas à 25 °C sob agitação orbital por 1 h, e entre cada etapa a membrana será lavada por 3 vezes com PBS-T. A visualização das reações será realizada pela adição de uma solução cromógena contendo DAB (tetrahidrocloreto de 3,3’-diaminobenzedina).
Quantificação e caracterização
A concentração de L. casei será determinada através de diluição seriada em meio ágar e posterior contagem de colônias. A quantificação do antígeno recombinante será realizada por purificação através de um sistema de cromatografia de afinidade ao níquel. Em seguida, a concentração das proteínas recombinantes será determinada por quantificação através do kit BCA Protein Assay (PIERCE), utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão. As vacinas recombinantes serão caracterizadas através da técnica de Western blot, onde, após a transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose, esta será incubada com o soro de suínos positivos para L. intracellularis e posteriormente adicionado o anticorpo IgG anti-pig conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich). A técnica será desenvolvida conforme descrito anteriormente.
Imunização e desafio
Para avaliar a imunogenicidade e potencial vacinal da construção recombinante camundongos e posteriormente suínos serão divididos em 7 grupos experimentais contendo 8 animais em cada e vacinados conforme segue: 1) Controle negativo (animais que não serão suplementados nem imunizados); 2) Administração de L. casei (via oral); 3) rLi purificada adsorvida no adjuvante hidróxido de alumínio (Al(OH)3)
(intramuscular); 4) LC-Li (via oral); 5) Enterisol® Ileitis (Boehringer Ingelheim) (via oral); 6) Vacina Porcilis® Ileitis (intramuscular). As vacinas experimentais serão compostas de 1x106 UFC de L. casei expressando ~100 μg do antígeno recombinante (rLi)e 1x109 UFC de L. casei expressando aproximadamente 400 μg do antígeno recombinante (rLi) em camundongos e suínos, respectivamente. Os animais receberão por três dias consecutivos a dose do microrganismo recombinante e receberão duas doses de reforço, também administradas por 3 dias consecutivos, com intervalo de 15 dias.
Amostras de sangue e fezes para avaliação sorológica e de microbioma serão coletadas com intervalo de 7 dias até o final do experimento.
Posteriormente, 21 dias após a última dose vacinal, camundongos e suínos serão desafiados via oral com 106,9 TCID50 bactérias L. intracelulares atenuadas vivas (PARK et al., 2018; PARK; WON; LEE, 2019). Após o desafio os animais serão monitorados para a observação de sinais de diarreia, conversão alimentar, e ganho de peso. Serão realizadas coletas periódicas de amostras fecais para quantificar DNA de L. intracellularis e então, avaliar a indução de imunidade protetora.
Avaliação da resposta imune
A resposta imune humoral será verificada através da de ELISA indireto, utilizando como antígeno: LC-Li; BT-Li, células inteiras de L. intracellularis; proteína rLi purificada. Brevemente, as placas de poliestireno serão impregnadas com os antígenos, e então adicionados os soros dos animais vacinados. Posteriormente, será adicionado o anticorpo secundário espécie específico (anti-mouse ou anti-pig) conjugado com peroxidase. A concentração dos antígenos e diluição dos soros será determinada em ensaios de checkerboard. Serão quantificadas as imunoglobulinas IgA e IgG e seus isotipos. Entre cada etapa, as placas serão incubadas por 1 h a 37 °C e lavadas com solução salina fosfatada contendo Tween 20 (PBS-T). A visualização da reação antígeno-anticorpo será realizada com a adição de solução cromógena contendo ortofenilenodiamina (OPD).
Para verificar a resposta imune celular serão coletados esplenócitos e linfonodos mesentéricos de camundongos e suínos, e amostras de células da mucosa do trato gastrointestinal de suínos. Também será realizado o isolamento e cultivo de
células polimorfonucleares (PBMC) obtidos a partir de sangue periférico total. As células serão cultivadas e estimuladas com o antígeno recombinante (rLi), LC-Li e L. intracellularis, como controle será utilizada a lectina Concanavalina A e o próprio meio de cultivo. Será realizada a extração do RNA total, a síntese de cDNA e então, a quantificação da transcrição do mRNA das citocinas IL-4, IL-8, IL-17 e IFN-y através de PCR quantitativo.
Para analisar a capacidade da vacina LC-Li de induzir imunidade protetora e/ou esterilizante contra Enteropatia Proliferativa, será realizada a quantificação do agente patogênico em amostras fecais. Para isso, será realizada a extração de DNA das amostras, e posterior amplificação de genes específicos de L. intracellularis por qPCR. O DNA das fezes será extraído a partir de uma diluição 10 vezes de 1 grama de fezes, utilizando kit de extração de DNA. Para a quantificação do DNA, uma curva padrão de DNA de L. intracellularis purificado será construída. Essa curva será utilizada na reação de qPCR para servir de padrão para as reações experimentais. Os dados brutos (valores de Ct) serão transformados por software em cópias por grama de fezes. O limite de detecção será de 100 cópias de DNA por grama de fezes.
Análise do microbioma do TGI
Amostras de fezes serão coletadas antes e depois dos ciclos de administração dos probióticos e armazenadas a temperatura de -70 °C até o momento da extração de DNA. As amostras de DNA serão isoladas utilizando kit de extração (QiAmp DNA Stool Mini Kit), sendo posteriormente enviadas para a empresa ZymoResearch (Irvine, CA, EUA) para caracterização do microbioma. A identificação do metagenoma será realizada com 10% PhiX spike-in usando Sequenciamento de Nova Geração através do sistema Illumina® MiSeq™, com o kit de reagente v3 (600 ciclos). Inicialmente, serão construídas bibliotecas de DNA específicas para ambos os grupos. Será realizado o sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S usando o kit Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (ZymoResearch, Irvine, CA), no qual primers 16S serão utilizados para amplificar a região V3-V4 do gene.

Ao final desse projeto, espera-se a obtenção de uma vacina constituída de epítopos específicos de L. intracellularis sendo entregues por L. casei P054 que proteja suínos contra Enteropatia Proliferativa.
O desenvolvimento de uma vacina nacional contra Enteropatia Proliferativa é de extrema relevância, sabendo que existem diferenças entre os patógenos locais daqueles que são isolados em outros países. A detenção da tecnologia de produção pelo Brasil proporcionará a sua independência neste setor e diminuirá despesas relacionadas a importação.
As vacinas que utilizam microrganismos probióticos como sistema de entrega de antígenos são uma tendência em animais de produção, já que concomitante com a indução da proteção contra determinado antígeno, os probióticos trazem soluções para problemas comumente encontrados em animais recém desmamados, como diarreia. Aliar a utilização de BAL com antígenos recombinantes induzirá respostas imunes protetoras e prolongadas, estratégia que facilitará o processo de administração da vacina, além de diminuir os custos para o produtor. Estabelecer um protocolo de expressão de antígenos recombinantes por L. casei, bem como uma estratégia da sua administração permitirá o estudo e desenvolvimento de vacinas probióticas para demais doenças de importância econômica no setor.