Nome do Projeto
Avaliação da atividade antimicrobina, citotoxidade, genotoxidade e estresse oxidativo de compostos bioativos em cultivo de células ZF-L e sobre larvas e peixe adulto da espécie Danio rerio
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
19/09/2022 - 19/09/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
Compostos bioativos são utilizados para diferentes aplicações terapêuticas. Tais compostos são representados por uma infinidade de compostos sintéticos, semi-sintéticos ou naturais. Podem apresentar inúmeras atividades como: antimicrobiana, antifúngica, antiviral, antiparasitária, anti-inflamatórias, antitumoral, etc. Exemplo típico de composto bioativos amplamente estudados atualmente são os herbicidas utilizados para o controle de plantas daninhas. O Brasil, além de ser um dos países que mais utilizam agroquímicos de forma legal, também apresenta indícios de utilização de produtos ilícitos. O uso indiscriminado de agroquímicos pode atingir organismos não-alvos, incluído seres humanos. Em ambientes aquáticos, os peixes são os principais organismos não-alvos, podendo produzir nestes efeitos agudos. De uma forma geral qualquer composto bioativo pode apresentar ou não atividade biológica cruzada com organismos vivos, independente de qual seja e também o ambiente em que habitam. A utilização de um modelo alternativo para realizar avaliações toxicológicas in vivo, avaliações preliminares in vitro podem auxiliar no processo de determinação de citotoxidade, genotoxicidade e estresse oxidativo em tecidos alvos nesses animais. Por isso, a determinação do efeito desses compostos in vitro e in vivo são de sua importância, Nesse contexto, surge a linhagem celular ZF-L (células hepáticas) e o modelo alternativo de Zebra-Fish (Danio rerio) que podem auxiliar de forma efetiva em estudos do efeito de compostos bioativos através da utilização de um modelo alternativo. Com o modelo é possível avaliar diferentes doenças (Diabetes, Alzheimer, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, câncer), citotoxidade, toxicidade aguda e crônica, genotoxidade, regeneração tecidual, quimio e fotoproteção, bem como o comportamento dos animais. Além disso, o modelo alternativo utilizando Danio rerio permite avaliar a atividade de um determinado compostos bioativo após a infecção com diferentes tipos de microrganismos.
Objetivo Geral
- Avaliar a citotoxidade e genotoxidade de compostos bioativos in vitro utilizando a linhagem ZF-L.
- Determinar CE50 (Concentração de Efeito) e/ou CL50 (Concentração Letal) em embriões de peixe-zebra expostos a diferentes concentrações de compsotos bioativos, baseados no protocolo para avaliação de toxicidade da OECD 2013, Fish Embryo Toxicity – FET – Test (OECD, 2013);
- Verificar o efeito das diferentes moléculas na sobrevivência e desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, através do FET, incluindo parâmetros letais e sub-letais, tais como, atraso no desenvolvimento e eclosão, alterações nos batimentos cardíacos, deformações e presença de edemas;
- Avaliar os efeitos das diferentes moléculas em nível bioquímico incluindo biomarcadores de neurotoxicidade (atividade de colinesterase), e enzimas representativas de diferentes vias metabólicas, glutationa S transferase (fase II do processo de desintoxicação), lactato desidrogenase (fase anaeróbica) de produção de energia) e Catalase (defesa antioxidante).
- Evidenciar a atividade antimicrobiana, antifúngica, antiviral e antiparasitária em modelo em in vitro, bem como em modelo de infecção in vivo utilizando Danio rerio.
- Utilizar o modelo in vitro e in vivo para avaliar a capacidade regenerativa e cicatrizante de compostos bioativos frente ao modelo de Danio rerio.
- Avaliar o comprotamento dos animais frente aos compostos bioativos.
- Determinar CE50 (Concentração de Efeito) e/ou CL50 (Concentração Letal) em embriões de peixe-zebra expostos a diferentes concentrações de compsotos bioativos, baseados no protocolo para avaliação de toxicidade da OECD 2013, Fish Embryo Toxicity – FET – Test (OECD, 2013);
- Verificar o efeito das diferentes moléculas na sobrevivência e desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, através do FET, incluindo parâmetros letais e sub-letais, tais como, atraso no desenvolvimento e eclosão, alterações nos batimentos cardíacos, deformações e presença de edemas;
- Avaliar os efeitos das diferentes moléculas em nível bioquímico incluindo biomarcadores de neurotoxicidade (atividade de colinesterase), e enzimas representativas de diferentes vias metabólicas, glutationa S transferase (fase II do processo de desintoxicação), lactato desidrogenase (fase anaeróbica) de produção de energia) e Catalase (defesa antioxidante).
- Evidenciar a atividade antimicrobiana, antifúngica, antiviral e antiparasitária em modelo em in vitro, bem como em modelo de infecção in vivo utilizando Danio rerio.
- Utilizar o modelo in vitro e in vivo para avaliar a capacidade regenerativa e cicatrizante de compostos bioativos frente ao modelo de Danio rerio.
- Avaliar o comprotamento dos animais frente aos compostos bioativos.
Justificativa
Testes de compostos bioativos tem sido alvo de inúmeros estudos por diferentes grupos de pesquisa no mundo. Os testes de citotoxidade visam avaliar diferentes moléculas com potencial, bem como sua aplicação em diferentes áreas da ciência. Um organismo não-alvo, seria o zebrafish (peixe-zebra). Uma abordagem integrada vem sendo executada, avaliando os efeitos tóxicos em vários níveis de organização biológica: letal, desenvolvimento embrionário e bioquímico. Tal modelo alternativo apresenta inúmeras vantagens em relação aos modelos in vivo rotineiramente utilizados na pesquisa.
Esta análise integrada da toxicidade pode contribuir para compreender os mecanismos de ação destes compostos, permitindo uma adequada caracterização do risco para os ambientes aquáticos, bem como extrapolados para outras aplicação na área da saúde e inovação.
Esta análise integrada da toxicidade pode contribuir para compreender os mecanismos de ação destes compostos, permitindo uma adequada caracterização do risco para os ambientes aquáticos, bem como extrapolados para outras aplicação na área da saúde e inovação.
Metodologia
A linhagem celular de hepatócitos de D. rerio adulto (ZF-L) (Cód. 0256) foi
adquirida do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ – Brasil). As células foram
cultivadas e mantidas em meio contendo 50% de L-15 com antibiótico/antimicótico
(Vitrocell®, Brasil), 35% DMEM de alta glicose (INLAB®, Brasil), 15% RPMI 1640
(INLAB®, Brasil), suplementado com 0,15 g/L de NaHCO3, 15 mM HEPES, 0,01
mg/mL de insulina e 10% de SFB inativado pelo calor (Vitrocell® Brasil).
Normalmente, a duplicação das células ocorre a cada 72 horas e a sua proliferação
depende da densidade celular.
Para garantir a aderência, de 24 a 48 horas antes de cada experimento, as
células foram semeadas em placas de 96 poços (KASVI®, Brasil). A incubação das
células tanto para o cultivo quanto para os tratamentos foram realizados em estufa a
28 °C sem a presença de CO2.
Protocolo para avaliação de toxicidade da OECD 2013, Fish Embryo Toxicity – FET – Test (OECD, 2013);
adquirida do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ – Brasil). As células foram
cultivadas e mantidas em meio contendo 50% de L-15 com antibiótico/antimicótico
(Vitrocell®, Brasil), 35% DMEM de alta glicose (INLAB®, Brasil), 15% RPMI 1640
(INLAB®, Brasil), suplementado com 0,15 g/L de NaHCO3, 15 mM HEPES, 0,01
mg/mL de insulina e 10% de SFB inativado pelo calor (Vitrocell® Brasil).
Normalmente, a duplicação das células ocorre a cada 72 horas e a sua proliferação
depende da densidade celular.
Para garantir a aderência, de 24 a 48 horas antes de cada experimento, as
células foram semeadas em placas de 96 poços (KASVI®, Brasil). A incubação das
células tanto para o cultivo quanto para os tratamentos foram realizados em estufa a
28 °C sem a presença de CO2.
Protocolo para avaliação de toxicidade da OECD 2013, Fish Embryo Toxicity – FET – Test (OECD, 2013);
Indicadores, Metas e Resultados
Como indicadores espera-se contribuir com a formação de recursos humanos de forma efetiva pela execução de projetos de pesquisa em diferentes programas de pós-graduação da UFPel. Caso gere algum produto que possa ser efetiva patentes relacionadas aos projetos. Além disso, que ocorra formação especializada de alunos capazes de trabalhar com o modelo de Danio rerio na UFPel.
A partir da utilização desse modelo in vivo espera-se adquirir resultados que contribuam com o surgimento de novos compostos bioativos com aplicabilidade em áreas relacionadas a bacteriologia, e que apresentem atividade antimicrobianas frente a diferentes agentes infecciosos.
Que o modelo também possa contribuir para a redução de estudos que dependem do biotério central e com isso reduza gastos com manutenção de animais de experimentação.
A partir da utilização desse modelo in vivo espera-se adquirir resultados que contribuam com o surgimento de novos compostos bioativos com aplicabilidade em áreas relacionadas a bacteriologia, e que apresentem atividade antimicrobianas frente a diferentes agentes infecciosos.
Que o modelo também possa contribuir para a redução de estudos que dependem do biotério central e com isso reduza gastos com manutenção de animais de experimentação.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| ANALICE BARCELLOS BALHEGO | |||
| ANDRESSA DE OLIVEIRA BLANKE | |||
| EDILA MARIA KICKHOFEL FERRER | 8 | ||
| EDUARDA BRAGA FERNANDES | |||
| GABRIELE OLIVEIRA LASSANCE | |||
| JANICE LUEHRING GIONGO | |||
| JOSIELE CANTARINI WEEGE | |||
| LUÍZE GARCIA DE MELO | |||
| MATEUS TAVARES KUTTER | 8 | ||
| MILENA MATTES CERVEIRA | |||
| PATRÍCIA DAIANE ZANK | |||
| RODRIGO DE ALMEIDA VAUCHER | 8 | ||
| Rafaely Piccioni Rosado | |||
| Rowena Moreira Silveira | |||
| RÓGER GIUSTI MILLER | |||
| Thobias Toniolo de Souza | |||
| Victor Dos Santos Barboza | |||
| Vítor Pereira Klein |
Recursos Arrecadados
| Fonte | Valor | Administrador |
|---|---|---|
| PROAP | R$ 5.000,00 | Coordenador |
Plano de Aplicação de Despesas
| Descrição | Valor |
|---|---|
| 339030 - Material de Consumo | R$ 5.000,00 |