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As neoplasias malignas são diagnosticadas com frequência na medicina Veterinária, dentre estas os mastocitomas ganham notariedade devido a agressividade e prognóstico desfavorável quando diagnosticados tardiamente. Os dados imuno-histoquímicos tem sido importantes na avaliação do prognóstico dos mastocitomas cutâneos de cães, neste sentido destaca-se a proteína do choque térmico HSP90, pois tem sido avaliada por regular a maturação, ativação e estabilidade de uma ampla gama de proteínas, muitas das quais estão envolvidas na transdução e outras vias importantes de malignidade. Assim, pretende-se quantificar e correlacionar o grau de expressão da HSP90 e sua influência na sobrevida e tempo livre de doença dos pacientes, a fim de determinar se essa proteína pode ser marcadora importante de prognóstico clínico dos pacientes com câncer.

3.1 Locais de estudos
A pesquisa será desenvolvida em conjunto na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), na Faculdade de Veterinária (FAVET) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFGRS), no Laboratório de Patologia Veterinária da UFPEL, em parceria com o Programa de Pós-Graduação da UFPEL e no Centro de Anatomia Patológica de Pelotas/RS.

3.2 Coletas e análises das amostras
O estudo será retrospectivo, quantitativo e descritivo, envolvendo espécimes de tumores de pacientes caninos portadores de mastocitoma cutâneo, submetidos previamente a coleta de material para exames histopatológicos e diagnóstico prévios.

3.3 Origem
Para o estudo serão utilizadas amostras histológicas fixadas em formalina e embebidas em parafinada de mastocitomas cutâneos provenientes de cães atendidos no HCV/FAVET da UFRGS e UFPel, que não receberam nenhum tratamento prévio.
Serão incluídos na pesquisa, amostras de mastocitoma de cães, que foram coletadas, de pacientes de ambos os sexos, que possuíam idade entre 2 e 15 anos com neoplasias em diferentes localizações anatômicas.
As amostras dos cães serão agrupadas conforme parâmetros histológicos (classificação tumoral de Patnaik et al. (1984) e Kiupel et al. (2011) para mastocitoma cutâneo, além de índice mitótico e margens cirúrgicas) e parâmetros clínicos (tamanho tumoral, velocidade de crescimento, presença de ulceração, localização, presença de metástase).
Será realizada avaliação das fichas de atendimento dos pacientes e será realizado contato telefônico com os tutores dos pacientes, a fim de investigar a sobrevida dos animais após o diagnóstico e também sobre tratamento realizado.

3.4 Armazenamento das amostras
O estudo será realizado através de amostras coletadas previamente. Serão utilizadas amostras histológicas fixadas em formalina e embebidas em parafinada, sendo estas provenientes de mastocitomas cutâneos de cães que obtiveram diagnóstico anteriormente e foram armazenadas na Favet - UFRGS e FV - UFPel.

3.5 Processamento das amostras e expressão dos resultados
Todas as amostras selecionadas para marcação da proteína serão processadas no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, sendo realizada a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) de material emblocado em parafina de mastocitomas cutâneos, provenientes de cães atendidos previamente.
A técnica de IHQ será realizada a partir dos cortes histológicos distendidos em lâminas silanizadas (Dako, Flex, IHC Microscopic Slides) e colocadas em estufa para aderência do corte. Posteriormente as lâminas serão desparafinizadas e recuperadas antigenicamente com o sistema PT LINK DAKO na solução Envision Flex DAKO. A incubação do anticorpo primário anti-HSP-90 (anticorpo monoclonal de rato, clone H9010, Invitrogen) na diluição de 1:200 será realizada no aparelho Autostainer Link 48 DAKO / Agilent. O sistema de detecção utilizado será o Envision DAKO, e como substrato revelador o DAB. Cada lâmina avaliada possuirá um corte do caso e um corte com um controle positivo anticorpo para garantir a qualidade da reação.
A marcação imuno-histoquímica de HSP do citoplasma, núcleo e/ou membrana será avaliada semi-quantitativamente, sendo classificada como 0 (sem marcação), 1 (>0 a <10% de células marcadas), 2 (10 a <50% células marcadas), 3 (células marcadas a 50%).

3.6 Obtenção do marcador da proteína HSP90
O marcador da HSP90 será adquirido de distribuidor comercial, sendo selecionado a partir da identificação realizada previamente e escolhidos conforme pesquisa realizada anteriormente acerca de outros estudos que utilizaram a marcação da proteína em outros tipos de tumores em cães.
3.7 Análises Estatísticas
A análise estatística será realizada no programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS®) v.18.0. Para todos os testes será considerado o nível de significância de p<0,05. As variáveis categóricas serão apresentadas por frequência absoluta (n) e relativa (%). As variáveis contínuas serão testadas para a normalidade de distribuição através do teste Shapiro-Wilk, e apresentadas como média e desvio padrão, ou como mediana e intervalo interquartil (25-75). Os testes estatísticos serão escolhidos de acordo com as características dos desfechos e fatores analisados (contínuo vs. categórico, com ou sem distribuição normal). Para avaliar a associação entre idade, raça, características clínicas, histológicas, e de tratamento serão realizados os testes Qui-quadrado, Mann-Whitney ou test-t para amostras independentes, de acordo com a distribuição das variáveis testadas.
As relações entre a marcação da proteína HSP90 (classificação semiquantitativa) e os graus histológicos dos tumores (classificação de Patnaik e Kiupel) e a evolução clínica dos cães, relacionada ao aparecimento de outras formações neoplásicas, serão analisadas utilizando o teste Qui-quadrado. Resíduos ajustados padronizados serão utilizados para detectar categorias com frequências superiores às esperadas. Para estimar o tempo de sobrevida será utilizado o teste de Kaplan-Meyer. O teste de log-rank será usado para comparar as curvas de sobrevida de acordo com a marcação da proteína HSP90, outras características histológicas e de tratamento, e a raça dos cães.

Caracterizar a imunomarcação da proteína HSP90 em mastocitomas cutâneos de cães que fizeram procedimento cirúrgico e que os tecidos foram encaminhados para avaliação histopatológica;
Quantificar a imunomarcação da proteína HSP90 em amostras de tecidos de mastocitomas cutâneos de cães;
Verificar se existem diferenças na expressão da HSP90 de acordo com os diferentes parâmetros clínicos e histológicos para mastocitoma cutâneo, índice mitótico e margens cirúrgicas;
Determinar se existe correlação entre a imunomarcação da HSP90 e a evolução clínica dos pacientes.
Resultados Esperados
Os mastocitomas cutâneos em cães são neoplasias malignas que possuem características histológicas e imunohistoquímicas variadas assim, espera-se que a imunomarcação de HSP90 possa ser utilizada para predizer a evolução clínica dos pacientes. Além disso a maior expressão da HSP90 em mastocitoma canino poderá ser utilizada para definir o prognóstico dos pacientes.