Nome do Projeto
Criopreservação de tecido testicular de cães domésticos (Canis familiaris)
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
21/12/2022 - 21/12/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Até o presente momento, a problemática consiste na preservação desse tecido por tempo prolongado e o uso das técnicas de criopreservação tem se mostrado como parte imprescindível neste processo. A troca de material genético, preservação de animais em extinção, subsídios para fonte de células germinativas, coadjuvante no tratamento da infertilidade, melhoramento genético pode ser enumerado como benefícios da criopreservação. Todavia, a heterogeneidade é característica do tecido testicular, o que deve ser considerado na escolha do protocolo adequado uma vez que, as espermatogônias, células de Leydig e Sertoli possuem um citoplasma rico, por conseguinte, são mais vulneráveis ao processo de congelação e descongelação (Hermo et al., 2010), devido a essa grande variedade de tipos celulares, a preservação do tecido testicular apresenta desafios no ponto de vista criobiológico (Lima et al., 2017). Tais células apresentam grande quantidade de água em seu interior, aumentando o risco da formação de cristais intracitoplasmáticos que resultam na destruição das organelas. Ademais, desidratação celular excessiva em consequência do choque osmótico decorrente da formação de cristais de gelo extracelulares e ruptura do citoesqueleto após serem expostas a temperaturas baixas podem ocorrer (Woelders et al., 2004). Um protocolo de congelação deve considerar o diluidor de criopreservação que será utilizado para equilibrar os fragmentos antes da congelação; tempo e temperatura de incubação dessas amostras além do tipo de protocolo de congelação escolhido, todos com o intuito comum de controlar as crioinjurias sofridas pelas células espermáticas durante o processo (Oliveira et al., 2006). Atualmente, os métodos mais utilizados para criopreservar tecido gonodal são o congelamento lento e a vitrificação (Abrishami et al., 2010). Baixas concentrações de crioprotetores são utilizadas no congelamento lento, afim de evitar possíveis danos celulares, os fragmentos de tecido são submetidos à redução gradual da temperatura. Já na vitrificação, utiliza-se soluções com altas concentrações de crioprotetores e a temperatura é rapidamente reduzida. As altas concentrações de soluções crioprotetoras embora possam ser citotóxicas (Lin et al., 2008), conforme a temperatura diminui adquirem uma consistência com alta viscosidade que evita a formação de cristais de gelo acarretando em menos efeitos nocivos em relação a viabilidade celular (Avila-Portillo et al., 2006). Durante o processo de criopreservação, alterações de membrana celular são responsáveis por parte da perda na qualidade das células espermáticas após descongelação (Sicherle et al., 2020; Kim et al., 2021). Tais alterações são consequência de fatores distintos, os quais podemos destacar o choque térmico resultando na formação de cristais de gelo no interior da célula espermática e por conseguinte alteração na pressão osmótica intra e extracelular resultando no rompimento da membrana. Com o intuito de amenizar tais efeitos deletérios à célula, faz-se necessária a diminuição da quantidade de água no interior da célula.

Objetivo Geral

Avaliar a viabilidade fecundante e integridade de células espermáticas oriundas de fragmentos de tecido testicular de cães domésticos (Canis familiaris), após o processo de criopreservação e identificar a curva de congelamento que melhor se adeque causando menos efeitos deletérios às celulas espermáticas

Justificativa

A criopreservação de sêmen é uma técnica de importância reconhecida, graças a sua grande contribuição ao desenvolvimento das práticas de reprodução assistidas utilizadas mundialmente. É de extrema relevância a manutenção e preservação do material genético de espécies selvagens e silvestres em especial as ameaçadas de extinção (Farstad, 2000; Watson, 2000). A criação de um banco criogênico também é importante para espécies de alto valor zootécnico como cães (Machado, 2016), visando o melhoramento genético das raças (Lucio, 2012; Cerdeira et al., 2020; Qamar, 2020), bem como seu transporte e utilização independente das barreiras geográficas (Mahiddine e Kim, 2021).
Fato importante a se destacar é a aproximação sentimental do homem com o cão, os mesmos são considerados animais de companhia, geralmente sendo castrados antes mesmo de atingirem a puberdade. A castração precoce pode acarretar no arrependimento posterior dos tutores, com isso, a congelação de testículos após tal procedimento poderia oferecer uma alternativa nestes casos (Abrishami et al., 2010).
A criobiologia para preservação espermática é o procedimento mais amplamente utilizado para estabelecer bancos de germoplasmas, mas ocasionalmente em alguns casos não é possível essa coleta dos espermazóides. Entre os possíveis casos podemos citar a azoospermia, animais pré-púberes, sazonalidade reprodutiva e castração precoce, são exemplos que impossibilitam a coleta convencional, nesses casos, a criopreservação de tecido testicular pode ser a única opção viável (Comizzoli, et al., 2014).
Nos últimos anos, o interesse pela criopreservação de tecido testicular tem se expandido devido ao sucesso de pesquisas paralelas com produção in vitro ou por transplantes de espermatogênese (Honaramooz, 2012). A criopreservação de tecidos é estratégia eficiente para contribuir com ferramentas de preservação de gametas, surgindo com uma ferramenta promissora para a reprodução assistida, permitindo o armazenamento de fragmentos contendo grande número de células germinativas em vários estágios de desenvolvimento, incluindo espermatozoides indiferenciados, que podem ser cultivados, garantindo produção ilimitada de espermatozoides (Silva, et al., 2015). Outro aspecto importante a ser considerado, é o potencial reprodutivo contido nos testículos dos animais que é descartado quando morrem ou são castrados, portanto, a capacidade de resgatar esse material pode representar um recurso valioso para o banco de genes. (Pukazhenthi et al., 2006, apud Silva et al., 2015).
Existem inúmeros relatos sobre a criopreservação de tecido testicular em humanos (Wyns et al., 2008), porcos (Abrishami et al., 2010), gatos (Mota et al., 2012), macacos, camundongos (Schlatt et al., 2002) e hamsters (Jahnukainen et al., 2007). Todavia é de suma importância destacar que a validação de um protocolo de congelação parra uma espécie não é necessariamente aplicada a outra aliado ao fato que a preservação da fertilidade por meio de banco de tecidos ainda está em fase experimental.
Até o presente momento, a problemática consiste na preservação desse tecido por tempo prolongado e o uso das técnicas de criopreservação tem se mostrado como parte imprescindível neste processo. A troca de material genético, preservação de animais em extinção, subsídios para fonte de células germinativas, coadjuvante no tratamento da infertilidade, melhoramento genético pode ser enumerado como benefícios da criopreservação. Todavia, a heterogeneidade é característica do tecido testicular, o que deve ser considerado na escolha do protocolo adequado uma vez que, as espermatogônias, células de Leydig e Sertoli possuem um citoplasma rico, por conseguinte, são mais vulneráveis ao processo de congelação e descongelação (Hermo et al., 2010), devido a essa grande variedade de tipos celulares, a preservação do tecido testicular apresenta desafios no ponto de vista criobiológico (Lima et al., 2017).
Tais células apresentam grande quantidade de água em seu interior, aumentando o risco da formação de cristais intracitoplasmáticos que resultam na destruição das organelas. Ademais, desidratação celular excessiva em consequência do choque osmótico decorrente da formação de cristais de gelo extracelulares e ruptura do citoesqueleto após serem expostas a temperaturas baixas podem ocorrer (Woelders et al., 2004). Um protocolo de congelação deve considerar o diluidor de criopreservação que será utilizado para equilibrar os fragmentos antes da congelação; tempo e temperatura de incubação dessas amostras além do tipo de protocolo de congelação escolhido, todos com o intuito comum de controlar as crioinjurias sofridas pelas células espermáticas durante o processo (Oliveira et al., 2006).
Atualmente, os métodos mais utilizados para criopreservar tecido gonodal são o congelamento lento e a vitrificação (Abrishami et al., 2010). Baixas concentrações de crioprotetores são utilizadas no congelamento lento, afim de evitar possíveis danos celulares, os fragmentos de tecido são submetidos à redução gradual da temperatura. Já na vitrificação, utiliza-se soluções com altas concentrações de crioprotetores e a temperatura é rapidamente reduzida. As altas concentrações de soluções crioprotetoras embora possam ser citotóxicas (Lin et al., 2008), conforme a temperatura diminui adquirem uma consistência com alta viscosidade que evita a formação de cristais de gelo acarretando em menos efeitos nocivos em relação a viabilidade celular (Avila-Portillo et al., 2006).
Durante o processo de criopreservação, alterações de membrana celular são responsáveis por parte da perda na qualidade das células espermáticas após descongelação (Sicherle et al., 2020; Kim et al., 2021). Tais alterações são consequência de fatores distintos, os quais podemos destacar o choque térmico resultando na formação de cristais de gelo no interior da célula espermática (Mahiddine et al.,2020) e por conseguinte alteração na pressão osmótica intra e extracelular resultando no rompimento da membrana (Silva, 2006; Mahiddine et al., 2020). Com o intuito de amenizar tais efeitos deletérios à célula, faz-se necessária a diminuição da quantidade de água no interior da célula (Dalcin e Lucci,2010).
Isto posto, a adição de crioprotetores para congelação promove uma melhor qualidade celular após a descongelação. As substâncias crioprotetores podem ser intracelulares ou extracelulares, sendo o primeiro capaz de penetrar na célula retirando a água intracelular (Lenz et al., 2018) ligando-se ao hidrogênio das moléculas de água aumentando assim a viscosidade do liquido intracelular diminuindo a formação de cristais de gelo durante o processo de congelação (Castro et al., 2011). Já os crioprotetores extracelulares promovem aumento na osmolaridade do meio externo à célula, favorecendo a saída de água intracelular favorecendo a diminuição de formação de cristais de gelo no interior da célula espermática (Siewert et al., 2018).
Com isto, esse projeto visa avaliar a viabilidade fecundante de células espermáticas oriundas de tecido testicular de cães domésticos (Canis familiaris) após processo de criopreservação através do método de vitrificação realizado em máquina de congelação de sêmen automatizada Cryogen comparando diferentes curvas de congelamento.

Metodologia

Após a castração os complexos testículos-epidídimos do mesmo animal serão acondicionados em tubos plásticos (50ml) contendo 20 ml do meio de transporte (composição do meio item 3.1). Os tubos serão transportados em tempo médio de 2-3 horas até o laboratório em caixa térmica de poliestireno contendo gelo reciclável, com temperatura de aproximadamente 4 ºC.
3.2 Meios
O meio de transporte será composto por solução salina NaCl 0,9% suplementada com estreptomicina (100 μg / ml) + penicilina (100 UI / ml). O meio de criopreservação terá em sua composição 2.4% Tris, 1.4% ácido cítrico, 0,8% glicose, 3% etilenoglicol, 20% gema de ovo, 0,06% penicilina sódica, 0,1% sulfato de estreptomicina, 1% EquexSTM paste® em água destilada
Como meio de manutenção será utilizada a solução de Talp (BotuFIV CAP® - Botupharma, Botucatu, São Paulo, Brasil), na qual também será realizada a extração dos espermatozoides do tecido testicular pós-descongelação para análise.
3.3 Confecção de fragmentos de tecido testicular:
Neste trabalho serão utilizados testículos de 10 cães adultos (1 ± 7 anos) e clinicamente saudáveis obtidos através de uma parceria com o Projeto Castração em Cães e Gatos desenvolvido pela Facudade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas e coordenado pelo Professor Fabricio de Vargas Arigony Braga, após orquiectomia bilateral de rotina durante uma campanha para esterilizar cães. Os testículos serão alocados em um recipiente plástico contendo meio de transporte (solução salina NaCl 0,9% suplementada com estreptomicina (100 μg/ml) + penicilina (100 UI/ml)), imediatamente resfriados a 4º C e transportados para o laboratório dentro de 2 e 3 h após a coleta.
Uma vez no laboratório, os testículos serão seccionados ao meio em plano sagital e cuidadosamente dissecados para a remoção da túnica albugínea e do parênquima testicular subjacente para a confecção de 18 fragmentos testiculares por animal. Após 3 lavagens em meio de transporte tamponado com fostato (PBS), os tecido serão seccionados em fragmentos de 2x2x2 mm (medidos com auxílio de um modelo de grade), com bisturi e pinças de dissecção em câmara de fluxo laminar à temperatura ambiente, sendo cada fragmento considerado uma unidade amostral.
Dos 18 fragmentos obtidos de cada animal, 3 serão analisados imediatamente após transporte (conforme descrito no item 3.3), os demais serão preparados para o processo de criopreservação (conforme descrito no item 3.4), sendo reavaliados após o processo de descongelação.

3.3 Avaliação da qualidade das células espermáticas:
Para recuperação espermática, os fragmentos serão alocados em placa de Petri contendo PBS e serão submetidas à técnica de fatiamento, a homogeinização será realizada por meio de pipetagem (pipeta de 100uL). A solução resultante do processo de fatiamento será filtrada em malha de nylon 40mm para melhor visualização das células espermáticas recuperadas. além de fixação de uma amostra de 10uL para posterior análise morfológica (Unni, 2012).

3.3.1 Avaliação dos Parâmetros de cinética de células espermáticas:
A mensuração da cinética espermática será realizada através do sistema automatizado computer assisted sperm analysis (Sperm Vision® 3.5, Minitub, Tiefenbach, Germany), em microscópio de contraste de fase 200 X (Axio Scope A1®, Zeiss, Germany), nos fragmentos in natura (refrigerados)e após o descongelação.
O descongelamentoserá feito após retirada dos frascos criogênicos de 2 ml do nitrogênio liíquido e submergidos em banho-maria a 60°C por 5 segundos, resultado em menos dano espermático que o descongelamento lento (Vizuete et al., 2014). Para a análise, uma alíquota de 10 microlítros da solução homogeneizada será colocada em lâmina pré-aquecida à 37° C.
Neste estudo serão avaliados os seguintes parâmetros: motilidade total (MT); motilidade progressiva (MP); velocidade curvilínea (VCL); velocidade linear progressiva (VSL); velocidade média da trajetória (VAP); retilineariedade (STR); lineariedade (LIN); coeficiente de oscilação (WOB); frequência de batimento flagelar cruzado (BCF); amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH); distância curvilínea (DCL); distância linear progressiva (DSL); e distância média da trajetória (DAP).

3.3.2 Avaliação dos parâmetros de funcionalidade das células espermáticas:
As análises de fluidez de membrana (MF); índice de fragmentação de DNA (FDNA); integridade de membrana (MI); funcionalidade mitocondrial (MIT); integridade de acrossoma (ACRO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) serão realizadas em citometria de fluxo - Attune® Acoustic Focusing (Life Technologies). Os eventos não espermáticos (detritos) serão eliminados com base nos gráficos de dispersão (Piehler et al., 2005), e pela seleção das células onde será utilizada uma coração utilizando Hoechst 33342. A estabilidade de florescência do citômetro será testada diariamente utilizando solução padrão (Invitrogen, CA, EUA).
A fluidez de membrana plasmática (MF) utilizará o corante fluorescente hidrofóbico, a merocianina 540 (M540) que se liga preferencialmente as membranas com lipídios frouxamente ligados, devido ao aumento da permeabilidade da membrana plasmática. As células serão classificadas em alta fluorescência e baixa fluorescência que correspondem à células com alta fluidez e baixa fluidez de membrana respectivamente (Fernadez-Gago et al., 2013). Os dados serão expressos como a percentagem de espermatozoides em cada categoria
O índice de fragmentação do DNA (FDNA) das células espermáticas será determinado por meio de propriedades da sonda metacromática Laranja de acridine (2 mg/mL) que será adicionada imediatamente antes da análise da amostra. Tal marcador emite fluorescência na cor vermelha quando se associa ao DNA de fita simples desnaturado e verde quando intercalado a hélice de DNA fita dupla (Jenkins et al., 2015).
A integridade de membrana plasmática (MI) será analisada pelo processo de permeabilização pela conjugação do PI (iodeto de propídio - 50μg/ml) e da CFDA (carboxifluoresceína diacetate - 1μg/ml). Após exposição das amostras, células coradas de verde são consideradas íntegras, todavia apenas células com injúrias emitirão fluorescência vermelha. Os dadosserão expressos como a percentagem de espermatozoides em cada categoria (Fernández-Gago et al.,2013).
A funcionalidade mitocondrial (MF) será avaliada utilizando o marcador Rodamina 123, após incubação a 37ºC por 15 minutos, onde a maior intensidade da fluorescência verde está relacionada com o maior potencial eletroquímico e consequentemente maior potencial de membrana mitocondrial (Silva et al., 2016).
A integridade do acrossoma (ACRO) será avaliada utilizando o lectina PNA combinado com isotiocianato de fluoresceína (10 µg FITC-PNA/mL) combinado com IP (7,5 µM), a avaliação será realizada após incubação a 37ºC por 15 minutos. Células que emitirem fluorescência verde possuem acrossomas intactos, já as que emitirem fluorescência vermelha estão com os acrossomas danificados (Martínez-Pastor et al., 2010). Os dados serão expressos como a porcentagem de espermatozoides em cada categoria.
A Produção de Espécies Reativas de Oxigênio Intracelular (ROS) será determinada através do reagente carboxy-H2DCF-DA (1mM) e IP (7,5 μM), marcador de estresse oxidativo que detecta ROS intracelular. H2DCFDA é oxidado para diclorofluoresceína (DCF), que emite fluorescência a 530 nm, em resposta excitação de 488 – nm (Domínguez-Rebolledo et al., 2011).
As leituras serão realizadas imediatamente após a adição dos fluorocromos à amostra de sêmen, e após a incubação à 37°C 22 por 60 min. O ROS será determinado pela intensidade mediana da fluorescência verde (indicador de oxidação) em células espermáticas viáveis. Os resultados serão expressos em taxa de ROS intracelular (Domínguez-Rebolledo et al., 2011).
3.4 Vitrificação automatizada
Três fragmentos de 2x2x2 mm de cada testículo (n=180) foram dissecados e submetidos a três lavagens por 30 s em meio em meio de transporte tamponado com fostato (PBS). Os fragmentos a serem criopreservados serão alocados em recipientes criogênicos de 2 mL contendo 0,5 ml o meio de criopreservação, após serão dispostos sobre as racks no congelador automatizado de acordo com as diferentes curvas de congelamento (conforme descrito no item 3.4.1). Após serão alocados em botijões de contendo nitrogênio líquido até o descongelamento.
3.4.1 Curvas de congelamento
Para a congelação, será utilizado o protocolo de congelamento de embriões previsto no congelador automático para a criopreservar os fragmentos de tecido testicular canino, utilizando as seis diferentes curvas referentes a espécie bovina para posterior comparação.Optou-se por utilizar a espécie bovina para a curva devido as semelhanças encontradas na proporção de ácidos graxos e colesterol nas membranas espermáticas entre tais espécies.

Indicadores, Metas e Resultados

• Curva de congelação que cause menos efeitos nocivos as células provenientes de fragmentos de tecido testicular após o processo de descongelação
• Orientação de um aluno deDoutorado
• Orientação de dois alunos de IniciaçãoCientífica
• Artigos e resumos expandidos em congressos nacionais e internacionais na área de reprodução animal
• Resumos em congressos de iniciaçãocientífica
• Artigos em revistas internacionais de altoimpacto.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CARINE DAHL CORCINI1
FERNANDA RODRIGUES MENDONÇA
INARAÃ DIAS DA LUZ
IZANI BONEL ACOSTA
JOSAINE CRISTINA DA SILVA RAPPETI
MARCIA PLA BLASCO

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