Nome do Projeto
Comparação entre os diluentes TRIS-GEMA e TRIS-PLASMA e o efeito dos aditivos mel de abelha e epididimossomas para refrigeração e congelamento de espermatozoides e tecido testicular de gatos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
21/12/2022 - 21/12/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Propõe-se neste projeto testar a viabilidade do diluente TRIS-GEMA purificado sobre células epididimárias felinas, além de diferentes concentrações de mel de abelha como protetor extracelular e fonte de ATP no descongelamento. Propõe-se também, a utilização de epididimossomas em diferentes concentrações. Teoriza-se que, devido à baixa maturidade dos espermatozoides encontrados nas porções iniciais do epidídimo e às diferentes linhagens de baixo grau de maturação presentes no tecido testicular, a exposição dessas células à estes vacúolos extracelulares será benéfica e melhorará a qualidade do descongelamento seminal.

Objetivo Geral

Avaliar os efeitos do diluente tris-gema purificado em comparação com tris-gema, além de observar o êxito de diferentes concentrações de mel de abelha e epididimossomas felinos sobre a viabilidade de espermatozoides epididimários e tecido testicular de gatos após resfriamento e congelamento.

Justificativa

Apesar do impulsionamento do mercado pet, animais de companhia ainda possuem valor econômico limitado, o que dificulta a realização de pesquisa com os mesmos (VAN SOOM, 2014) e essa diferença é ainda mais evidente quando nos referimos ao gato. Por exemplo, no congresso EVSSAR de 2013, apenas 14,5% das publicações estava relacionada à reprodução felina (SPARKES, 2018).
A situação é ainda mais inquietante uma vez que nos damos conta das particularidades felinas. Os membros da família Felidae possuem diversas características anatômicas e fisiológicas que os diferenciam das demais espécies. Podemos citar como exemplosno macho: presença de espículas queratinizadas na glande (LITTLE, 2015), espermatogênese pouco resistente à calor e umidade (FAVRE, 2022), além de um alto grau de teratospermia (PUKAZHENTHI et al., 2006). A membrana espermática de felinos acometidos por teratospermia é mais suscetível à dano pelo frio, possuem maior sensibilidade à variação osmótica, menor estabilidade de DNA, maior probabilidade de dano acrossomal e consequentemente menor capacidade de fertilização (PUKAZHENTHI et al., 2001).
Existem outros fatores que dificultam a reprodução de felídeos, como por exemplo a agressividade que essas espécies demonstram na cópula (MARTINS E JUSTINO, 2015). Também são animais de fotoperíodo positivo e ovulação induzida, ou seja, a fêmea em geral necessita da cópula para ovular; além disso, tanto em fêmeas quanto em machos, a maior secreção de melatonina em noites longas (hormônio produzido e secretado pela glândula pineal) desempenha papel inibitório na habilidade reprodutiva da família. No macho, um longo fotoperíodo negativo, acarretará em menor concentração espermática no ejaculado. Na fêmea, um fotoperíodo positivo curto pode significar falta de ciclicidade (STORNELLI et al., 2004).
Apesar de amplamente utilizados, os processos de congelamento/descongelamento são extremamente estressantes para a célula. Podemos citar como alguns dos estressores enfrentados pelo espermatozoide como formação de cristais de gelo intra e extracelulares, variação brusca na osmolaridade e pH, que são processos que contribuem para um maior dano à membrana celular, aumento dos níveis de espécies reativas em oxigênio (ROS) e menor integridade do DNA (NANGIA et al., 2013; HEZAVEHEI et al., 2018; VALIBOUR et al., 2021).
Espermatozoides com DNA danificado são capazes de fertilizar oócitos, tanto in vivo quanto in vitro, a diferença é que a primeira possui diversas barreiras naturais, enquanto é bastante exacerbada in vitro, uma vez que as barreiras de seleção natural são contornadas (PERÉZ-CEREZALES et al., 2010). O oócito possui enorme capacidade de reparo do DNA, através de múltiplos mecanismos, contudo se por ventura o dano ao DNA excede essa capacidade de reparo, erros de leitura poderão acontecer durante a replicação, gerando mutações ou prejudicando a metilação do DNA dos indivíduos desta ninhada (MENEZO et al., 2010; VALCARCE et al., 2013).
São conhecidos e relatados diversos casos que comprovam que o dano ao DNA espermático causará dos mais diversos obstáculos ao desenvolvimento do indivíduo, seja na nidação, desenvolvimento embrionário ou exacerbamento de doenças perinatais e do desenvolvimento. Estes eventos já foram descritos em diversas espécies, em diversos estágios do desenvolvimento, e seus efeitos deletérios à prole já foram confirmados. Em peixes, por exemplo, gerou uma progênie com eclosão tardia e com taxa de crescimento reduzida (NUSBAUMER, 2019).
Camundongas da progênie fruto de inseminação artificial com sêmen congelado tiveram aumento na ansiedade, déficit na memória espacial de curto prazo e hipolocomoção. Também houve um aumento significativo na mortalidade nos primeiros cinco meses de vida dos animais dos grupos teste, assim como aumento nas patologias apresentadas após análise anatomopatológica dos animais idosos, cuja eutanásia foi realizada com 16 meses de idade (FERNÁNDEZ-GONZALES et al., 2008).
Recentemente, foi possível identificar diversos microRNAs expressos diferencialmente (DEmiRs) em camundongos, ou seja, com uma hipo ou hiper expressão; Destes, numerosos eram parálogos a DEmiRs humanos (XU et al., 2021). Podemos citar dois como exemplo: a expressão em excesso de um deles inibe significativamente a proliferação celular e promove a apoptose celular em células de leucemia mieloide crônica ( GENG et al., 2020 ; JIAO et al., 2020), enquanto o excesso de outro pode promover a proliferação celular e a progressão do ciclo celular no câncer ( QIN et al., 2017 ).
Em humanos, foi relatado que crianças fruto de material congelado e nascidas sem problemas perinatais tiveram neurodesenvolvimento normal, porém não tão elevado quanto as que foram fruto de concepção natural, sendo mais significativa a diferença nas áreas de locomoção e linguagem. Ou seja, existem estudos relatando que a criopreservação de células reprodutivas está associada à padrões de neurodesenvolvimento menores que a média (NEVES, 2016).
Alguns dos outros eventos relatados em progênie proveniente de material congelado incluem: apoptose após as primeiras clivagens (FATEHI et al., 2006), diminuição na implementação do embrião, aborto e doenças neonatais (ZINI et al., 2008; AITKEN et al., 2009), taxas de transcrição alteradas para genes envolvidos no crescimento e diferenciação celular (PERÉZ-CEREZALES et al., 2010), desregulação das vias de morfogênese de órgãos embrionários, metabolismo de glicogênio, formação de placóides ectodérmicos mal posicionados ou defeituosos e desregulação da auto fosforilação de proteínas (KING, 2022).
O diluente TRIS-GEMA tem sido usado como diluente controle, uma vez que possui resultados aceitáveis no descongelamento do semen de gatos. O Tris (Tris-hidroximetil-aminometano – H2NC(CH2OH)3) atua como tampão iônico bipolar em pH entre 7,0 e 9,0, estando disponível comercialmente com alto grau de pureza (SILVA, 2005). A gema de ovo de galinha é comumente adicionada ao TRIS (formando o diluente TRIS-GEMA), e promove a proteção da membrana plasmática, restaura fosfolipídios perdidos durante o choque térmico, sendo também uma fonte proteica no diluente (SILVA, 2005; MARTINS, 2005). O TRIS-GEMA purificado (TEYP) ainda não foi testado em gatos, porém, devido à remoção de sujidades e substâncias que danificam a respiração celular e motilidade espermática (CORCINI et al, 2016), espera-se que o TEYP, diluente teste da primeira fase deste projeto e esperançosamente o diluente controle na segunda, melhore o resfriamento e o congelamento do sêmen felino.
O mel é utilizado hoje por pesquisadores por ser uma substância natural que não requer esterilização nem causa efeitos colaterais consideráveis, tornando-se um interessante aliado para resguardar células biológicas na criopreservação, sendo umas das substâncias testadas no projeto. O mel possui mais de 25 açúcares, principalmente glicose e frutose. Estudos anteriores (SAITO, 1994) comprovaram que a taxa de sobrevivência espermática aumentou significativamente quando os dois açúcares foram utilizados em conjunto. O mel também possui outras substâncias bioativas, tais como vitaminas, ácidos orgânicos, antioxidantes e enzimas, possuindo atividades anticancerígenas, imunossupressoras, antioxidantes, antimicrobianas, anti-inflamatórias e antimutagênicas (ABDEL-LATIF, 2005; PÉREZ, 2007; ALVAREZ-SUAREZ, 2010; MAKHLOUFI, 2010; BRUDZYNSKI, 2011; MANYI-LOH, 2011; BOGDANOV, 2011).
Já foram identificados até o momento em torno de 600 compostos voláteis em méis. Possuem compostos cíclicos, como benzeno e seus derivados, álcoois, furano, norisoprenóides, aldeídos, ésteres de ácido, pirano, terpeno e seus derivados, assim como enxofre, cetonas e hidrocarbonetos. Trinta e um minerais diferentes também foram encontrados em amostras, incluindo fósforo, sódio, cálcio, enxofre, magnésio e cloro. Dentre os ácidos orgânicos que podem ser encontrados, podemos citar o ácido glucônico como principal. Além disso, o mel contém vestígios de vitaminas do complexo B, ou seja, riboflavina, niacina, ácido fólico, ácido pantotênico e vitamina B6, bem como vitamina C, ou seja, ácido ascórbico. Uma variedade de enzimas também está presente no mel, como oxidase, invertase, amilase, catalase, etc (ABINAWANTO, 2017; CHEEPA, 2022).
Apesar dos dados limitados, ainda possui resultados encorajadores. O mel já foi utilizado com sucesso no congelamento de espermatozoides de cabras (MAIDIN et al., 2018), peixes gourami (ABINAWANTO et al. ,2017), garanhões árabes (EL-SHESHTAWY et al. 2016), e bagre africano (MUCHLISIN et al., 2015).
Epididimossomas possuem diâmetro variável, entre 50 e 500nm, sendo liberados do epitélio epididimal por um mecanismo de secreção apócrina(CABALLERO, 2011). Essas substâncias irão controlar a motilidade dos espermatozoides, protegem contra estresse oxidativo, eliminam espermatozoides defeituosos e induzem a capacidade do espermatozoide de interagir com a zona pelúcida (HASSAN, 2021).
A co-incubação de espermatozóides por 3 h com fluido luminal ou epididimossomos seguida de imunocoloração revelou que as porcentagens de espermatozoides contendo cenexina aumentaram significativamente em amostras co-incubadas com suspensões de epididimossomo. Ou seja,amostras tratadas obtiveram melhores resultados em comparação com amostrasnão tratadas (ROWLISON, 2018).
Propõe-se neste projeto testar a viabilidade do diluente TRIS-GEMA purificado sobre células epididimárias felinas, além de diferentes concentrações de mel de abelha como protetor extracelular e fonte de ATP no descongelamento. Propõe-se também, a utilização de epididimossomas em diferentes concentrações. Teoriza-se que, devido à baixa maturidade dos espermatozoides encontrados nas porções iniciais do epidídimo e às diferentes linhagens de baixo grau de maturação presentes no tecido testicular, a exposição dessas células à estes vacúolos extracelulares será benéfica e melhorará a qualidade do descongelamento seminal.

Metodologia

A metodologia proposta, passo a passo, é a seguinte:
• Coleta epidídimos e testículos: os complexos testículo-epidídimo (CTE) serão obtidos através da parceria com clínicas parceiras, após procedimentos de rotina, e com o HCV, após procedimentos de rotina. Após excisão cirúrgica, os CTEs de cada animal serão alocados individualmente em tubos plásticos Falcon de 50 mL, contendo solução salina a 0,9%, aquecida a 37º, de forma a evitar choques térmicos (SIEMIENIUCH, 2007; BARBOSA, 2019), alocados na geladeira, onde podem permanecer por até 24 horas resfriados para processamento (GAÑÁN, 2009).
• Transporte: os testículos serão transportados dentro dos tubos de Falcon contendo NaCl 0,9% e alocados em uma caixa isotérmica para o laboratório em até duas horas (BARBOSA, 2019; PINTUS, 2021).
• Processamento:
o Tempo máximo para transporte e processamento: se conservados a 5ºC, os testículos podem ser processados em até 24 horas (GAÑÁN, 2009), porém, segundo Toyonaga (2011), epidídimos armazenados à temperatura ambiente podem ser processados em até 12 horas sem influências óbvias na qualidade do esperma.
o Preparo dos epidídimos e testículos para coleta: os CTEs serão lavados três vezes em PBS suplementado com antibiótico (Penicilina 100UI/mL e estreptomicina 100mg/mL), para então terem tecidos estranhos, vasos e túnica albugínea removidos. Os testículos e epidídimos deverão então ser separados e serão novamente lavados três vezes em PBS suplementado com antibiótico (BUARPUNG, 2013; MACENTE, 2017). Após, o testículo será identificado e alocado em um tubo Falcon com PBS suplementado de antibiótico, à temperatura ambiente, para aguardar processamento. Epidídimos serão processados primeiro.
o Processamento epidídimo:
 Procedimento preferencial para coleta de espermatozoides do epidídimo: os espermatozoides serão coletados por lavagem do ducto deferente com PBS por meio de uma agulha calibre 29, tomando cuidado para evitar a contaminação da suspensão de espermatozoides com sangue (BOGLIOLO, 2001).
 Procedimento alternativo para coleta de espermatozoides do epidídimo: os epidídimos inteiros serão dissecados, alocados em placas Petri e posteriormente picados com lâmina de bisturi em 0,5 mL de PBS a 38ºC e mantidos aquecidos nessa temperatura por 10 minutos, para permitir que os espermatozoides flutuem para o meio (PINTUS, 2021).
 Processamento do epidídimo propriamente dito para coleta de epididimossomas: os fragmentos de epidídimo serão alocados em placas petri para serem picados com lâmina de bisturi em PBS. A amostra descansará por 10 minutos de forma a permitir que o fluído luminal se escoe. Após, serão alocados em tubos de microcentrífuga para descarte de detritos celulares. Inicialmente serão centrifugados a 700g por 10 minutos e 3000g por 10 minutos à temperatura ambiente, com o sobrenadante sendo transferido para um novo tubo após cada centrifugação. A fração dos epididimossomas será isolada do fluido luminal restante por ultracentrifugação a 100.000g por duas horas a 4ºC, sendo ressuspensa em PBS fresco (tubos de policarbonato de 3,5 ml, com enchimento de 3 ml cada) (ROWLISON, 2020). A concentração proteica será calculada através do método de quantificação proteica de Bradford, e após esta, a concentração proteica será ajustada para 16ug de proteína total/uL, podendo ser mantida congelada para uso posterior.
o Centrifugação: a suspensão de esperma será centrifugada a 700g por seis minutos em temperatura ambiente, o sobrenadante sendo removido. 50uL de TRIS-glicose será adicionada ao pellet restante, e uma fração de 10uL será removida para avaliação da concentração espermática, a ser posteriormente ajustada com diluente base. A concentração será ajustada conforme abaixo. Após, uma alíquota será removida e fixada para morfologia (MANEE-IN, 2014; KUNKITTI, 2016).
o Concentração: as amostras serão analisadas pós-centrifugação de forma a averiguar volume e concentração da amostra, sendo então reajustada com o diluente base para 60x10^6. Após, uma alíquota é removida e fixada para morfologia.Posteriormente, uma vez que será realizada um congelamento em duas etapas, a concentração será reajustada de 1:1 com o diluente em questão (ROWLISON, 2021).
o Exposição aos epididimossomas: após a coleta dos espermatozoides, estes serão co-incubados por 1 hora e 15 minutos a 38ºC com as amostras de EV diluídas a uma concentração de 4μg de proteína total/μL, antes de serem processados para resfriamento.
o Resfriamento: segundo Gáñanet al. (2009), a motilidade e a integridade acrossômica do esperma de gato são maiores após o descongelamento quando um longo período de equilíbrio foi utilizado em comparação com tempos mais curtos.As amostras, alocadas em tubos eppendorfs, deverão ser posicionadas nos flutuadores de EVA e colocados em bandejas com água em temperatura ambiente, que posteriormente serão alocados na caixa de resfriamento minitubea 4ºC. As amostras contendo epididimossomas terão tempo de equilíbrio a 38ºC antes de serem submetidas à refrigeração e mantidas no processo de glicerolização (LENGWINAT E BLOTTER, 1994; SIEMIENIUCH E DUBIEL, 2007; MARTINS et al., 2009; VILLAVERDE et al., 2009; MARTINS et al., 2009).Após o período de 12-24 horas, em que eles estarão resfriados, as amostras terão uma alíquota retirada para análise no CASA e uma para análise no citômetro. Após serão manejadas para congelamento. As amostras do grupo tratamento da exposição aguda à gabapentina deverão ser descartadas após análise.
o Congelamento: as amostras deverão ser alocadas em tubos de 0,25mL, seladas e mantidas resfriadas até que possam ser posicionadas horizontalmente a 7cm acima do vapor de nitrogênio (TOYONAGA et al., 2010) durante 10 minutos, esperando-se chegar a uma taxa de resfriamento de 3,85ºC/min, antes de serem mergulhadas em nitrogênio líquido, posicionadas nos copos e mantidas sob refrigeração até o momento do descongelamento.
o Descongelamento: o descongelamento em temperaturas mais altas e por tempos mais curtos, resultou em maior motilidade espermática em comparação com o descongelamento em menores temperaturas (NELSON et al., 1999).Os canudos, então, devem ser retirados do nitrogênio líquido e imediatamente posicionados na água aquecida a 60ºC, durante 5 segundos, o que resultaria em menor dano espermático do que o descongelamento lento (RIJSSELAERE et al., 2007; VIZUETE et al., 2014). Após, os canudos deverão ter sua superfície seca e então esvaziados em eppendorfspara análise.
o Processamento dos testículos: os testículos deverão ser secos com gaze limpa, medidos quanto a tamanho (largura, comprimento) e pesados separadamente em balança digital de precisão. (THUWANUT, 2012). Uma amostra deverá ser separada para análise histomorfológica enquanto as outras serão utilizadas para o estudo de congelamento de tecido testicular.
o Fragmentos testiculares: cada testículo será cortado em duas partes iguais, e cada metade foi cortada em 10 pedaços. O corte dos fragmentos se dará por meio de uma lâmina de bisturi, no plano mediano e transverso do testículo, sendo que as regiões periféricas (próximas da túnica albugínea e da região do mediastino) serão descartadas, com o objetivo de obter das regiões de maior concentração de túbulos seminíferos pelo menos 20 tiras de 0,3 cm² de cada testículo (MACENTE, 2017). Dois pedaços serão utilizados como controle, e os outros 18 para 9 diferentes diluentes, todas as amostras em duplicata.
o Resfriamento: as amostras serão alocadas em eppendorfs com soluções à temperatura ambiente e mantidas por 10 minutos para equilibrar, e em seguida alocados em refrigeração à 4ºC por 24 horas. Uma das amostras de cada tratamento e do controle serão retiradas após resfriamento, serão divididas ao meio – uma parte para análise de qualidade e morfologia espermática, enquanto a outra é processada normalmente para análise histomorfológica, sendo que o segundo pedaço de cada tratamento e controle será manejado para criopreservação e análise posterior.
o Criopreservação: os fragmentos a serem criopreservados deverão ser alocados em frascos criogênicos de 2 mL contendo 0,5 mL do meio de congelamento em questão. Após, serão equilibrados à 4ºC durante 10 minutos, alocados sobre rack a 4cm do nitrogênio líquido por 10 minutos, para então serem mergulhados à -196ºC, alocados nos raques e botijões até o descongelamento (MACENTE, 2017).
o Aquecimento: após o período de armazenamento, os criotubos serão retirados dos cilindros contendo os fragmentos testiculares e imersas em solução de PBS a 50ºC durante 5 segundos. Em seguida, serão imersos em soluções com ordem decrescente de sacarose (0,5M; 0,25M; 0M) adicionadas de MEM (Ham’s F10) e FBS 20%. Os banhos deverão ser realizados a temperatura ambiente, com duração de 5 minutos cada e possui como objetivo a retirada dos crioprotetores (LIMA et al., 2018).
o Avaliação histomorfológica: os fragmentos testiculares frescos, resfriados e descongelados serão preparados para avaliação histológica de acordo com a rotina do laboratório.
o Avaliação da qualidade espermática: para recuperação espermática, o fragmento será alocado em placa petri contendo PBS, serão submetidos à técnica de fatiamento e em seguida a solução será agitada por meio de pipetagem (pipeta de 100uL). Então, esta solução será filtrada em malha de nylon 40um para melhor individualização dos espermatozoides recuperados. A amostragem de espermatozoides será avaliada no CASA e no citômetro, igualmente aos espermatozoides epididimários, além de fixação de uma amostra de 10uL para posterior análise morfológica (MACENTE, 2021).

Indicadores, Metas e Resultados

Um diluente, de alta qualidade e de baixo custo, que possa também ser utilizado para a formação de banco de germoplasma de gatos e felinos silvestres.
• Orientação de um aluno de Doutorado.
• Orientação de três alunos de Iniciação Científica.
• Artigos e resumos expandidos em congressos nacionais e internacionais na área de reprodução animal e/ou pequenos animais.
• Resumos em congressos de iniciação científica.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CARINE DAHL CORCINI1
FERNANDA RODRIGUES MENDONÇA
INARAÃ DIAS DA LUZ
IZANI BONEL ACOSTA
JOSAINE CRISTINA DA SILVA RAPPETI
MARCIA PLA BLASCO

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