Nome do Projeto
Desenvolvimento de uma vacina recombinante para o controle de Haemonchus contortus
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/03/2023 - 15/03/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
As perdas econômicas causadas por nematódeos gastrintestinais na ovinocultura mundial apontam para a necessidade do desenvolvimento de estratégias eficazes no controle desses parasitos. O uso de anti-helmínticos se vê cada vez mais restrito devido ao surgimento de cepas resistentes aos mais diversos compostos químicos disponíveis no mercado. Causador da hemoncose, Haemonchus contortus é o nematódeo mais importante para pequenos ruminantes, ovinos e caprinos. O hábito alimentar hematófago é responsável por grandes perdas para o hospedeiro, como anemia severa, perda de peso, lesões na mucosa e óbito do animal. Nas últimas décadas diversos estudos buscaram o desenvolvimento de vacinas capazes de amenizar os impactos resultantes da hemoncose, usando das mais diversas moléculas. Assim, o objetivo desse estudo é determinar a influência de uma nova proteína recombinante, a Hc1 na resposta imune de ovinos. No experimento conduzido com ovinos, 50 animais serão divididos em 5 grupos: o grupo 1 receberá Closantel Sódico (10 mg/Kg) ou anti-helmíntico disponível, o grupo 2 será inoculado com 2 mL contendo PBS + Al(OH)3 o grupo 3 2 mL contendo 400 µg Hc1 e os grupos 4 e 5 receberão 2 mL contendo 400 µg Hc1 + 116 µg de LTB e 145 µg de TT-Th, respectivamente. Todos os grupos serão vacinados nos dias 0 e 21. Amostras de sangue serão coletadas via intravenosa semanalmente durante 70 dias. Nos dias 0 e 28 serão coletadas amostras de sangue total para o cultivo de PBMCs e posterior extração de RNA para avaliação das citocinas. Também serão coletadas amostras de fezes para realização de contagem de ovos por grama de fezes e coprocultura. Ao final do experimento, um animal de cada grupo será eutanasiado para a remoção do omaso, abomaso, rúmen, baço e gânglios linfáticos mesentéricos. A expressão e antigenicidade de Hc1 será demonstrada por Western Blot e ELISA indireto. As análises estatísticas serão conduzidas nos softwares GraphPad Prism 8 e em linguagem R. Espera-se que a partir desse estudo seja possível desenvolver uma nova vacina como controle de H. contortus. Nosso estudo contribuirá com a busca de potenciais formas de tratamento da hemoncose.  

Objetivo Geral

Avaliar a proteína recombinante Hc1 como imunógeno na resposta imune protetora contra Haemonchus contortus

Justificativa

Infecções causadas por nematoides gastrintestinais (NGI), sobretudo por tricostrongilídeos da espécie Haemonchus contortus resultam em grandes perdas econômicas na ovinocultura mundial (AMARANTE, 2004; MOLENTO et al., 2013). Considerada uma das mais importantes infecções causadas por nematódeos nas regiões tropicais e subtropicais (O’CONNOR; WALKDEN-BROWN; KAHN, 2006), a hemoncose pode levar o animal a apresentar lesões na mucosa, anemia severa, alterações na absorção de nutrientes e até mesmo o óbito em casos mais graves (BESIER et al., 2016).
Os anti-helmínticos usados no controle dessa verminose atualmente apresentam sua eficácia reduzida pelo uso sem planejamento prévio, que culminou na resistência dos parasitos a uma ampla gama de princípios ativos (MOLENTO et al., 2013). A procura por métodos alternativos motivou diversos estudos que buscaram encontrar soluções para o tratamento da hemoncose, entre eles o desenvolvimento de vacinas (EHSAN et al., 2020). Atualmente existe apenas uma vacina comercial licenciada, a Barbervax®, que apresenta em sua composição as proteínas de membrana intestinal H11 e H-gal-GP (SMITH et al., 1997; SMITH; SMITH; MURRAY, 1994). Estudos iniciais demonstraram uma redução de 72% e 75% na carga parasitária de animais vacinados com H-gal-GP e H11 respectivamente (SMITH et al., 1997; SMITH; SMITH; MURRAY, 1994).
Devido a presença da resistência aos antiparasitários em helmintos causadores de verminoses, a procura por novos métodos de controle é extremamente importante para amenizar seus impactos causados na ovinocultura. O presente estudo pretende contribuir na busca por novos tratamentos para hemoncose ovina.

Metodologia

4.1 Desenho in silico da Hc1

Inicialmente, a sequência a ser clonada no plasmídeo foi predita pela ferramenta IMMUNORANK, concebida pelo Laboratório de Imunologia e Genômica e Parasitos (LIGP) da Universidade Federal de Minas Gerais. Analisaram-se características referentes a epítopos de linfócitos B, T CD8+, T CD4+, proteínas intrinsicamente desordenadas (PID), similaridades com proteínas do hospedeiro ou outros patógenos, N-Glicosilação ou O-Glicosilação. Após tentativas de expressão sem sucesso da sequência única, optou-se por construir a sequência peptídica em repetições (in tandem) e então a síntese se deu no plasmídeo pET23a+ pela empresa GenONE (Rio de Janeiro, Brasil).

4.2 Transformação e propagação do plasmídeo pET23a+/Hc1

A cepa de E. coli TOP10F utilizada para a propagação de plasmídeos será transformada com pET23a+/Hc1. A transformação por choque térmico consiste em adicionar uma colônia isolada em um microtubo contendo 100 µL de Cloreto de Cálcio (CaCl2) 100mM e 2 µL do plasmídeo de interesse. O microtubo então é incubado em banho de gelo por 3 minutos, seguido por banho quente de 1 minuto a 42 °C e novamente incubado em banho de gelo por 3 minutos. A presença de Cloreto de Cálcio propicia a permeabilidade da célula bacteriana, o que permite a entrada do plasmídeo no organismo. Logo após, adicionam-se 500 µL de LB Low Salt líquido na amostra que então é mantida em agitação de 180rpm e 37 °C durante uma hora. 50 µL do cultivo são adicionados em uma placa de LB Agar contendo Ampicilina na concentração de 100ug/mL e cultivado por 14h a 37 °C. O restante do cultivo transformado é expandido em 10mL de LB Low Salt, incubado sob agitação de 180rpm e 37 °C durante 14 horas.

4.3 Avaliação das cepas de expressão de Hc1

E. coli de expressão C41, C43, PlysS, (D3) Ril, Rosetta™ e Star serão transformadas por choque térmico, mencionado anteriormente. Diferentes concentrações de IPTG (Isopropil β-D-1-thiogalactopiranosidio) e temperaturas serão testadas objetivando as melhores condições de expressão para produção da proteína recombinante em maior escala. Amostras de 1mL dos cultivos serão coletadas em diferentes tempos de expressão para posterior avaliação com a técnica de SDS-PAGE.

4.4 Produção em larga escala de Hc1

Definidas as melhores condições de expressão, na próxima fase do experimento será produzida proteína em grandes quantidades. Uma colônia isolada da linhagem selecionada de E. coli transformada com pET23a+/ Hc1 será adicionada a 100mL de LB Low Salt líquido suplementado com Ampicilina na concentração de 100 µg/mL e Cloranfenicol 100 µg/mL para as linhagens PlysS, Ril e Rosetta por 14h a 37°C e agitação de 180rpm. O cultivo então será expandido em 1L de LB Low Salt líquido também suplementado com Ampicilina a 100 µg/mL e mantida sob agitação de 180rpm e melhor temperatura de expressão até atingir a DO600nm entre 0,6-0,8 (fase log) e ser induzida com IPTG na concentração final e tempo de expressão definidos anteriormente.

4.5 Purificação da Hc1

Os cultivos bacterianos serão centrifugados durante 15 minutos a 7.000 x g para a obtenção dos “pellets”. Cada pellet celular será eluido em tampão de lise (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; Imidazol 10mM), submetido ao processo conhecido como sonicação que consiste em submeter as células a ondas de ultrassom visando a lise total das células e liberação das proteínas para o meio. Posteriormente a amostra será incubada por 1 hora com lisozima 100 µg/mL e então centrifugada por 15 minutos a 7.000 x g e o sobrenadante obtido armazenado a 4 °C. O pellet resultante será eluido em tampão de solubilização (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; CH4N2O; Imidazol 10mM) e mantido durante 14 horas a 4°C para solubilização de proteínas insolúveis. Após a incubação a amostra será centrifugada por 15 minutos a 7.000 x g. Os sobrenadantes serão clarificados utilizando membrana cut off de 0,8 μM para que os restos celulares sejam removidos das amostras. A purificação das amostras será realizada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel, que tem a capacidade de reter proteínas recombinantes que possuem em sua construção a cauda de poli histidina. Tampões de eluição (tampões de lise e solubilização contendo 500mM de Imidazol) serão utilizados em diferentes concentrações para a recuperação da proteína. Todas as concentrações serão analisadas em SDS-PAGE.

4.6 Caracterização de Hc1

As amostras dos testes de expressão mais promissores serão submetidas à técnica de Dot Blot para detecção da proteína recombinante. 5 µL de cada amostra são pipetados em membrana de nitrocelulose (Bio-Rad), bloqueadas com 10mL de uma solução de PBS-T (phosphate buffered saline + 0,05% de Tween 20) e 5% de leite em pó desnatado, e então incubadas por 1h a 37°C. A membrana então é lavada com PBS-T de três a cinco vezes e mergulhada em 10mL de PBS-T contendo anti-6XHis diluído 1:5.000 por 1h a 37°C. A membrana é então lavada novamente com PBS-T e incubada com o anticorpo secundário anti-mouse 1:5.000 durante 1h a 37°C. Realiza-se a última lavagem da membrana e então é aplicada a solução reveladora composta por 10 mL de Tris-HCl 50mM pH7.5, 1mL de NiSO4 0,3%, 10 µL de H2O2 e 0,06g de DAB (3,3’-Diaminobenzidina). Para as amostras purificadas será realizada a técnica de Western Blot, que consiste na eletrotransferência das “corridas” de um SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose. Após a transferência, a membrana passa pelas mesmas etapas realizadas no Dot Blot.

4.7 Imunização de camundongos

50 camundongos Balb/c serão divididos em 5 grupos vacinais discriminados na tabela 1. Os animais serão mantidos no Biotério Central da UFPel, acondicionados sob temperatura controlada 22 ( 2 °C) e ciclo de iluminação claro-escuro (12 horas), tendo ração (sem adição de antibióticos e antifúngicos) e água ad libitum. Ao final do experimento, os animais serão eutanasiados para extração dos órgãos de interesse ao estudo.

Tabela 1 – Tratamentos e doses para imunização de camundongos.
Grupo Tratamento Dose Número de animais
1 Al(OH)3 - 10
2 Hc1 50 µg 10
3 Hc1 + LTB 25 µg + 25 µg 10
4 Hc1 + TT-Th 25 µg + 25 µg 10
5 Bactéria Inativada 50 µg 10

4.8 Imunização de ovinos

40 ovinos com aproximadamente 20 meses mantidos em campo nativo serão divididos em 3 grupos vacinais descritos na tabela 2. Os animais serão identificados, distribuídos aleatoriamente e registrados em fichas individuais contendo o número do animal, grupo vacinal e sexo. As doses serão aplicadas nos dias 0, 21 e 35.
Tabela 2 – Tratamentos e doses para imunização de ovinos.
Grupo Tratamento Dose Número de animais
1 PBS 2 mL 8
2 Vermífugo 2 mL 8
3 Hc1 400ug 24

4.9 Coletas e análise de soro

Amostras de sangue serão coletadas dos animais semanalmente do dia 0 ao dia 70 em tubos de coleta a vácuo contendo ativador de coágulo. O soro obtido a partir da centrifugação do material coletado será congelado em duplicatas para posterior análise por ELISA indireto. Nesse ensaio, placas de 96 poços são sensibilizadas com a proteína de interesse em diluição padronizada anteriormente em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e mantidas a 37 °C overnight. A placa é então bloqueada com 100 µL de PBS-T + leite em pó a 5% por 1h a 37 °C. Posteriormente são adicionados à placa os soros dos ovinos imunizados, além dos controles positivos e negativos diluídos em PBS-T, e incubados por 1h a 37 °C. Após a incubação, é adicionado soro anti-IgG ovino conjugado com peroxidase diluído conforme orientação do fabricante em PBS-T e novamente incubado por 1h a 37 °C. A reação é então revelada com solução de tampão citrato/fosfato (TPS) 10 mL, 0,004g de ortofenilenodiamina e 10 µL de H2O2. A placa é protegida da luz durante 15 minutos e a reação interrompida após esse tempo com a adição de 50 µL/poço de H2SO4 a 3%. A leitura das placas é feita em espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 492nm.

4.10 Contagem de ovos nas fezes

Semanalmente serão coletadas amostras de fezes para realização da Técnica de Gordon e Whitlock em placas McMaster. 2 gramas de fezes são pesados e homogeneizados em 58 mL de solução hipersaturada de açúcar ou cloreto de sódio. A solução é filtrada e pipetada até completar as duas áreas em câmara de McMaster. A placa então fica em repouso por 1 ou 2 minutos para que ocorra a flutuação dos ovos que serão contados em ambas as áreas, somados e multiplicados por 100. Recomenda-se que a técnica seja realizada em triplicata.

4.11 Coprocultura

Para identificação e contagem de larvas do terceiro estágio dos nematódeos gastrintestinais presentes nos animais será realizada a técnica de Roberts e O’Sullivan, conhecida como coprocultura. Amostras de fezes são coletadas diretamente da ampola retal do ovino, misturada à duas partes de serragem para uma de fezes com o auxílio de pistilo ou bastão. Após homogeneizar a mistura, cobrir o recipiente com a placa de vidro (garantindo que haja aeração) e manter em estufa durante 7 dias a 28 °C. Transcorrido o tempo de cultivo, encher o recipiente com água morna, inverter a placa de Petri e aguardar de 2h a 4h para transferir o conteúdo da placa de Petri para o tubo de ensaio e armazenar a 4 °C para posterior análise. Uma amostra é retirada do tubo e pipetada em lâmina com a adição de lugol para morte das larvas. Então, a partir de características morfológicas, as larvas são identificadas.

Indicadores, Metas e Resultados

• Avaliar ação de uma nova molécula no controle de Haemonchus contortus de animais vacinados;
• Estabelecer a melhor forma de vacinação dos ovinos com Hc1;
• Avaliar as variações na resposta imune de animais vacinados e não vacinados;
• Ampliar o conhecimento sobre moléculas imunogênicas usadas no controle de verminoses.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
JÉFERSON VIDART RAMOS
MAYARA CAETANO ABREU
NEIDA LUCIA CONRAD
VITÓRIA SEQUEIRA GONÇALVES

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