Nome do Projeto
DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA RECOMBINANTE PARA ROTAVÍRUS EQUINO
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
19/04/2023 - 19/04/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O objetivo deste estudo é desenvolver uma vacina recombinante para ERV capaz de induzir resposta protetora nos neonatos através da imunidade passiva. As proteínas de interesse serão selecionadas através de bioinformática e será obtido um plasmídeo sintético pET-23a(+) contendo as sequências dos genes que codificam estas proteínas. Posteriormente, esta serão purificadas através de um sistema de cromatografia de afinidade ao níquel. O vetor será fusionado a diferentes cepas de E. coli visando selecionar a melhor expressão da proteína recombinante posteriormente, serão quantificadas. Para avaliar a capacidade dos alvos recombinantes, 30 éguas gestantes provenientes do Centro de Ensino e Experimentação em Equinocultura da Palma (CEEEP), da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), serão divididas em três grupos: Grupo Controle (n=10; PBS + Al(OH)3 10% - Sigma®); Grupo Rota (n=10; 400g da proteína recombinante + Al(OH)3 10% - Sigma®); Grupo Vacina Comercial (n=10; vacina comercial Rotamix Equin, Biochemiq®, Argentina). As vacinas serão administradas via intramuscular no músculo peitoral, no volume de 2 mL, mediante antissepsia prévia, aos 270 dias de gestação, sendo realizado um reforço vacinal 21 dias após a primeira dose. Serão realizadas coletas de 10 mL sangue das éguas, através da venopunção da jugular externa, para obtenção de soro, antes da primeira vacinação e a cada 10 dias até o momento do parto. Posteriormente, as coletas serão realizadas mensalmente até 90 dias após o parto. Serão obtidas amostras de 10 ml de sangue de cada potro, através da venopunção da jugular externa, para obtenção de soro, e de 15 g de fezes da ampola retal, antes da ingestão do colostro, 24 horas após o nascimento e com 7, 15, 30 dias de vida e mensalmente até o terceiro mês de idade. Posteriormente, será realizada uma coleta de sangue total em “pool” de cada grupo, totalizando 100ml por grupo, para o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Para avaliar a resposta imune humoral frente à vacinação será utilizada a técnica de ELISA indireto, enquanto que a resposta imune celular frente à vacinação será avaliada através do isolamento de PBMCs e da análise de indução da transcrição de mRNA de citocinas pró-inflamatórias perante o estímulo com a proteína recombinante. As amostras de fezes serão submetidas a extração de RNA e diagnóstico de rotavirose por PCR. Através deste estudo, esperamos disponibilizar uma vacina recombinante contra ERV equino, capaz de superar as limitações das vacinas atualmente disponíveis e de gerar imunidade cruzada entre os ERV comuns em equinos.

Objetivo Geral

Desenvolver uma vacina recombinante para RV equino capaz de induzir imunidade protetora nos neonatos através da imunidade passiva.

Justificativa

Entre as principais causas de morbidade e mortalidade em sistemas de criação de equinos estão as enterocolites, caracterizadas por um quadro de diarreia que, posteriormente, pode evoluir para um processo de desidratação severa, endotoxemia, septicemia e morte (MAGDESIAN, 2014). O rotavírus (RV) equino possui distribuição mundial e é o principal enteropatógeno detectado em potros com enterocolite (MAGDESIAN, 2014; FREDERICK et al., 2009; SLOVIS et al., 2014). Este vírus pertence à família Reoviridae, subfamília Sedoreovirinae, gênero Rotavirus (CARTENS, 2010), é não envelopado e possui genoma de RNA fita dupla segmentado (BAILEY et al. 2013). O sequenciamento do genoma de nove RV isolados em equinos propõe que G3P[12] e G14P[12] são os principais RV equinos, enquanto que os demais, menos descritos na literatura, são casos de transmissão cruzada entre espécies (BAILEY et al, 2013).
A enterocolite por RV acomete principalmente potros de três dias a três meses de vida. Esta se caracteriza principalmente por má absorção, devido a replicação viral no citoplasma dos enterócitos presentes no ápice das vilosidades do duodeno, jejuno e íleo, resultando na lise celular e atrofia das vilosidades. O RV também produz uma enterotoxina viral, denominada NSP4, que atua através de diversos mecanismos, como o aumento dos níveis intracelulares de cálcio para viabilizar a replicação viral nos enterócitos (BAILEY, 2013). Além da diarreia, potros acometidos podem apresentam pirexia, apatia, anorexia, desidratação e intolerância a lactose. O período de incubação da doença é de geralmente 1-4 dias, enquanto a disseminação viral através das fezes pode ocorrer durante a fase clínica, com duração de 1-12 dias, após a resolução da diarreia e em potros com infecção subclínica (CONNER & DARLINGTON, 1980; DWYER et al., 1990).
Quando ocorrem surtos de RV em criatórios de equinos, a morbidade pode atingir 100% dos potros, o que ressalta a importância da implementação de medidas de controle e profilaxia da doença. Além do isolamento de animais infectados e desinfecção adequada das instalações e fômites, é recomendada a vacinação das éguas no terço final da gestação (BAILEY et al., 2013). Contudo, o desenvolvimento de uma vacina efetiva para éguas gestantes continua sendo um desafio. Vacinas atenuadas potencialmente estimulariam adequada
produção local de IgA, porém, são neutralizadas pelas imunoglobulinas maternas. Além disso, existe a dificuldade de desenvolver uma vacina com equilíbrio entre atenuação e imunogenicidade (BAILEY et al, 2013).
Por esse motivo, as três vacinas licenciadas para equinos são inativadas, desenvolvidas nos Estados Unidos, Japão e Argentina. As duas primeiras são monovalentes, enquanto a vacina Argentina é trivalente, porém, possui apenas uma cepa isolada de equino. As três vacinas demonstraram aumento das concentrações de anticorpos nas éguas vacinadas e em seus respectivos potros (POWELL et al., 1997 BARRANDEGUY et al., 1998; IMAGAWA et al., 2005). Contudo, um estudo realizado em Kentucky, região que possui diversos criatórios de equinos, demonstrou que cepas G14 são predominantes na população local, com diferenças antigênicas significativas quando comparadas com a cepa presente na vacina comercial americana. Além disso, a maioria dos casos de rotavirose ocorre em potros nascidos de éguas vacinadas (CAROSSINO et al., 2018).
No Brasil, muitos criatórios de equinos utilizam empiricamente vacinas comerciais desenvolvidas para o RV bovino, mesmo não havendo estudos que comprovem imunidade cruzada com o RV equino, devido à ausência de uma vacina nacional e a dificuldade em importar os produtos licenciados para equinos. Além disso, as vacinas inativadas para RV geram imunidade de forma parcial, como demonstrado previamente (BARRANDEGUY et al., 1998; IMAGAWA et al., 2005). A utilização de uma vacina com antígeno recombinante poderia superar as limitações das vacinas atualmente disponíveis e gerar imunidade cruzada entre os RV comuns em equinos. Neste contexto, nosso estudo propõe o desenvolvimento de uma vacina de subunidade para o RV equino, através da seleção de proteínas recombinante.

Metodologia

Obtenção e caracterização da proteína recombinantes: Será obtida uma quimera recombinante a partir da avaliação das sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas virais de interesse e seleção de peptídeos. Posteriormente, será obtido um plasmídeo contendo o gene sintético. O vetor será fusionado a diferentes cepas de E. coli visando selecionar a melhor expressão da proteína recombinante. Para avaliar a expressão, será utilizada a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12%, sendo comparado o perfil de proteínas através da presença de bandas no gel, antes e após a indução da expressão das proteínas. A confirmação da expressão será realizada através da técnica de Western blot, na qual as proteínas serão transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas com anticorpos que se ligam a cauda de histidina presente na construção da proteína recombinante. A proteínas recombinante será purificada através de um sistema de cromatografia de afinidade ao níquel e, posteriormente, a concentração desta será quantificada através do Kit BCA Protein Assay (PierceTM), utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão.
Éguas e protocolo vacinal: Para avaliar a capacidade dos alvos recombinantes em estimular resposta imune serão utilizadas 30 éguas gestantes e seus respectivos neonatos, pertencentes ao Centro de Ensino e Experimentação em Equinocultura da Palma (CEEEP), Capão do Leão/RS. Os animais serão mantidos em piquetes de campo nativo melhorado com azevém (Lolium multiflorum) e água ad libitum durante todo o experimento. As éguas serão divididas em três grupos, sendo estes: Grupo controle (n=10; PBS + Hidróxido de Alumínio Al(OH)3, Sigma®), Grupo vacina comercial (n=10; Rotamix Equin®, Argentina), Grupo vacina recombinante (n=10; 400μg da proteína recombinante + 10% Al(OH)3,Sigma®). A primeira dose da vacina será administrada por via intramuscular, mediante antissepsia prévia, entre 270-300 dias de gestação e um reforço vacinal será realizado 14 dias após a primeira dose. A vacina comercial argentina será administrada conforme as recomendações do fabricante. Os partos ocorrerão sem intervenção humana, em piquetes menores e limpos.
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Coletas de sangue das éguas e potros: Serão realizadas coletas de sangue das éguas antes da primeira vacinação e a cada 10 dias, até 90 dias após o parto. Nos potros, a primeira coleta de sangue será realizada em até 48 horas após o nascimento e, posteriormente, serão realizadas coletas quinzenais até o segundo mês de vida. As amostras serão obtidas através da venopunção da jugular externa, utilizando tubos sem anticoagulante e agulhas Vacutainer®. Após a retração do coágulo, os tubos contendo sangue serão centrifugados a 800 x g, o soro será aliquotado em tubos do tipo eppendorf e armazenado a -20ºC até posterior análise.
ELISA indireto: Para avaliar a resposta imune humoral frente à vacinação será utilizada a técnica de ELISA indireto. Brevemente, placas de poliestireno 96 poços (Olen modelo K30-6096, Kasvi) serão sensibilizadas com a proteína recombinante e mantidas a 4 ºC por 18 horas. Posteriormente, as placas serão bloqueadas com leite em pó 0,5%, os soros testados serão adicionados na diluição escolhida e incubados por 60 minutos a 37 °C. O soro conjugado anti-equino será utilizado na diluição 1:7.000 durante 90 minutos a 37 °C. A revelação será realizada adicionando cromógeno/substrato em tampão citrato/fosfato (TPS) e mantendo a placa no escuro durante 15 minutos. A reação será interrompida pela adição de H2SO4 1N. As absorbâncias serão medidas no leitor de microplacas (TP-Reader, Thermo Plate®), utilizando comprimento de onda de 492 nm.
Isolamento de PBMCs e avaliação da transcrição de mRNA de citocinas pró-inflamatórias: A resposta imune celular frente à vacinação será avaliada através do isolamento de PBMCs e da análise de indução da transcrição de mRNA de citocinas pró-inflamatórias perante o estímulo com a proteína recombinante. As PBMCs serão isoladas a partir de amostras de sangue total centrifugadas a 990 x g e 20 ºC por 40 minutos. A lise das hemácias presentes no material coletado será realizada a partir da adição da solução de lise (RBC lysis), seguida de uma centrifugação a 450 x g e 20 ºC por 10 minutos. Posteriormente, será realizada
a lavagem das células com solução de Hanks, seguida de uma nova centrifugação a 450 x g e 20 ºC por 10 minutos. As células serão ressuspendidas em meio RPMI®-1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino (v/v) e incubadas a 37 ºC e 5% de CO2. Após 20 horas de cultivo, as células serão submetidas a três estímulos diferentes: 10 μg de RotaQ10, 10 μg de concanavalina A (controle positivo) e somente meio RPMI®-1640 (controle negativo). Após 24 horas de estímulo, as células serão coletadas e armazenadas em Trizol® a -70 ºC. Posteriormente, será realizada a extração do mRNA celular, que servirá como molde para a síntese de cDNA. Serão obtidos os primers para as sequencias que codificam as citocinas de interesse e a indução da transcrição de mRNA das citocinas pró-inflamatórias será quantificada pelo equipamento qPCR Mx30005P QPCR System (Agilent Technologies).
Soroneutralização: A capacidade neutralizante dos anticorpos vacinais contra o RV equino G3P[12] será determinada através de avaliação da neutralização do efeito micro-citopático (CPE). Os anticorpos serão diluídos de 1:10 a 1:5120 e, posteriormente, 100μl dessas soluções serão misturados em 1:1 com suspensão contendo 108 UFP de cepas de RV G3P[12] e incubadas a 37 ºC por uma hora. A solução contendo vírus-anticorpo será transferida para placas de 96 cavidades contendo monocamadas de células e incubadas a 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2. Serão utilizados controles contendo somente o vírus e somente os anticorpos. O efeito micro-citopático será observado a cada 24 horas durante seis dias. O título de anticorpos neutralizantes será expresso como o valor recíproco da maior diluição de anticorpos vacinais capaz de neutralizar o vírus.
Análises estatísticas: Os dados gerados serão analisados através dos softwares Statistix 10 e SigmaStat 3.5.

Indicadores, Metas e Resultados

Disponibilizar uma vacina recombinante contra o RV equino, capaz de superar as limitações das vacinas atualmente disponíveis e de gerar imunidade cruzada entre os RV comuns em equinos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CARLOS EDUARDO WAYNE NOGUEIRA1
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
NEIDA LUCIA CONRAD
RODRIGO CASQUERO CUNHA
VITÓRIA MÜLLER
VITÓRIA SEQUEIRA GONÇALVES

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