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A região sul do Rio Grande do Sul, principalmente os municípios de Pelotas e Rio Grande,
registraram aproximadamente 1000 casos de esporotricose animal e humana em menos de uma
década, dados alarmantes quando feita a relação de proporção entre os casos do Rio Grande do Sul
e do Rio de Janeiro, dada a diferença no tamanho da população e extensão territorial dessas duas
regiões afetadas.
A condução de estudos que possibilitem a identificação e epidemiologia das espécies
circulantes na população é necessária em virtude do elevado número de casos de esporotricose na
região sudeste do Rio Grande do Sul e sua perspectiva de rápida disseminação, levando em
consideração o retrospecto de epidemias em estágio mais avançado, como no caso do Rio de
Janeiro, no qual a Secretaria de Saúde do Município registrou um aumento de 400% no número de
casos no ano de 2016.
O Rio Grande do Sul possui um cenário epidemiológico favorável para a realização do projeto
proposto; possibilitando um estudo abrangente e integrado de desenvolvimento a curto/médio prazo,
que envolve a colaboração entre pesquisadores e alunos (pós-graduação, graduação e iniciação
científica) da Universidade Federal de Pelotas. Ainda, a equipe multiprofissional de pesquisadores
possui expertise no diagnóstico e na condução de estudos sobre a esporotricose, sendo essa micose
a maior casuística e principal linha de pesquisa do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia
Veterinária FAVET/UFPel, originando diversas publicações científicas do grupo de pesquisa
relacionado.
Os resultados do presente projeto possibilitarão ampliar o conhecimento sobre os aspectos
clínicos, laboratoriais, terapêuticos e epidemiológicos desta micose, contribuindo para auxiliar nas
ações de prevenção e controle da esporotricose no Rio Grande do Su

6.2 Isolados
Serão utilizadas cepas de Sporothrix sp pertencentes ao Centro de Diagnóstico
e Pesquisa em Micologia Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, isoladas de casos de
esporotricose em felinos, caninos e humanos naturalmente infectados e
provenientes de diversos municípios da região sudeste do estado do Rio Grande do Sul. As células
fúngicas foram isoladas diretamente de lesões de pele, mucosas e órgãos e cultivadas em duplicata
em agar Mycosel® (Difco Laboratorios, Detroit, Michigan) e agar Sabouraud dextrose Difco
Laboratorios, Detroit, Michigan) incubadas em temperaturas de 25ºC e 37ºC. Posteriormente à
identificação fenotípica como Sporothrix sp. os isolados foram repicados em PDA (agar potato
dextroser - Difco Laboratorios, Detroit, Michigan) e mantidos na micoteca em temperatura ambiente.
Esses isolados estocados na micoteca serão repicados em meio agar Sabouraud dextrose e
posteriormente será realizada a extração do DNA para identificação molecular das espécies.
6.3 Caracterização molecular
O DNA genômico dos isolados de Sporothix spp. será extraído através técnica adaptada in
house utilizando Breaking buffer (2% Triton X100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0,
1mM EDTA pH 8,0), Fenol: Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1) e pérolas de vidro. Os locus
calmodulina (CAL) (O’Donnell et al. 2000) e espaçador transcrito interno (ITS) do rDNA (Zhou et al.
2014) serão amplificados utilizando primers degenerados de CAL - CL1 (5’ - GAR TWC AAG GAG
GCC TTC TC-3’) e CL2A (5’-TTT TTG CAT CAT GAG TTG GAC-3’); e ITS 1 (5’-TCC GTA GGT GAA
CCT GCG G-3’) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’), respectivamente. As reações serão
preparadas em volume final de 100 µL: 0,2 mM de dNTPs, 1 U de Taq DNA Polimerase, 3,5 mM
MgCl2, tampão 1X, 0,2 pmol de cada primer. Realizadas em termociclador (Ampliterm - Thermal
Cyclers) sob as seguintes condições: desnaturação inicial de 94 °C por 5 minutos, seguida de 30
ciclos de 94 °C por 1 minuto; anelamento a 55 °C por 1 minuto e extensão de 72 °C por 1 minuto; com
extensão final de 72 °C por 10 minutos. Os produtos da amplificação (10 µL) acrescidos de 1µL de
tampão de corrida 5X serão submetido a eletroforese em gel de agarose 2%, em TBE 1X (45 mM
Tris, 4.5 mM ácido bórico, 1 mM EDTA dissódico, pH 8,3) durante 40 min a 100 v e corados com
brometo de etídeo (0,5 mg/mL), durante 30 min e visualizado em luz ultravioleta. Os produtos da
amplificação serão purificados por Kit illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE
Healthcare). O DNA será quantificado pelo método fluorimétrico em espectrofotômetro Qubit (Thermo
Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Os fragmentos de DNA serão analisados em sequenciador
ABI 3730 DNA Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando kit BigDyeH Terminator
v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Os fragmentos foram sequenciados em ambas as
direções, visando aumentar a qualidade dos dados. A montagem das sequências será realizada
através do software Vector NTI (Vector NTI, InforMax, Inc, USA). As sequencias serão analisadas
através da plataforma BLASTN (http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) e depositadas no GenBank.
6.4 Análise filogenética
A relação filogenética entre os isolados de Sporothix será determinada através da
combinação da análise das sequências de CAL + ITS utilizando estimativa de máxima
verossimilhança (maximum-likelihood estimation- MLE) e método Neighbor Joining (NJ) em software
MEGA 6 (Tamura et al. 2013). O dendrograma será estimado utilizando 1.000 repetições de
“bootstrap”. A distância evolutiva entre sequencias relacionadas será determinada pelo modelo
Tamura-3- parâmetros (Tamura, 1992).
6.5 Tratamento de Resíduos Biológicos e Químicos
Os resíduos biológicos (materiais contaminados com resíduos biológicos) serão autoclavados e
acondicionados em sacos plásticos apropriados para "Material Biológico". Após, estes resíduos serão
recolhidos e destinados pela empresa especializada contratada pela Universidade Federal de Pelotas.
Os perfurocortantes serão acondicionados em caixas Descarpack rígidas até que atinjam 2/3 da
sua capacidade. As caixas são semanalmente recolhidas pela Comissão de Saúde e Ambiente de
Trabalho da Unidade. Os resíduos químicos gerados serão separados, rotulados e encaminhados
para Coordenação de Gestão Ambiental (CGA/PRAINFRA) da UFPel para os devidos procedimentos
de reciclagem e/ou descarte de material químico.

A identificação dos isolados do complexo Sporothrix schenckii pertencentes ao
Centro de Pesquisa em Micologia Veterinária-MICVET/UFPel, possibilitará futuros estudos
sobre a esporotricose e seu agente, sua biologia, reprodução, perfis de suscetibilidade à
diferentes antifúngicos, e a resposta a moléculas antifúngicas alternativas, além do estudo
das cepas resistentes entre outras possibilidades de pesquisas que dependem da
caracterização das espécies.
 Os resultados obtidos neste estudo irão propiciar a ampliação do conhecimento sobre os
aspectos clínicos, terapêuticos, laboratoriais, imunológicos e epidemiológicos da
esporotricose, contribuindo para a prevenção e controle dessa epidemia no estado do Rio
Grande do Sul.
Publicação de estudos científicos.