Nome do Projeto
Avaliação da segurança e propriedade probiótica antidepressiva da Hanseniaspora uvarum PIT001 em modelo animal de camundongos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
23/05/2023 - 30/09/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O transtorno psicológico da depressão debilita mais de 280 milhões de pessoas do mundo e é considerado multifatorial. Desta forma, o uso de tratamentos as quais possam ser aplicados em diferentes vias são imperativos. O uso de probióticos é um tratamento que está em ascensão, capaz de modular o eixo microbiota-intestino-cérebro. Através dessa modulação, é possível reverter e prevenir os sintomas depressivos, reverter e prevenir a inflamação e neuroinflamação e a reduzir o estresse oxidativo. Neste projeto, nos propomos o uso de um novo probiótico, a Hanseniaspora uvarum PIT0001, uma levedura utilizada na fermentação de vinhos e capaz de dar aromas distintos a essa bebida. Estudos anteriores conduzidos pelo o laboratório de microbiologia do departamento de biotecnologia da UFPel viram que esse fungo foi capaz de sobreviver no pH do trato gastrointestinal e não provocou a liberação de citocinas inflamatórias pelo sistema imune. Por essa razão, esta levedura se mostra promissora para estudos em animais para avaliar suas prioridades de modular o sistema nervoso e o sistema imune, prevenir sintomas do tipo depressivos em camundongos e prevenir o estresse oxidativo em um modelo animal de depressão com lipopolissacarídeos bacterianos. Este projeto contará com 2 protocolos, sendo o primeiro para ver a sua segurança e propriedade probiótica, e o segundo para ver seu efeito antidepressivo e anti-inflamatório caso o protocolo 1 tenha resultados favoráveis

Objetivo Geral

Este projeto tem como objetivo geral caracterizar a segurança da administração de 14 dias da H.
uvarum PIT001 e caracterizar sua propriedade probióticas antidepressivas em um protocolo de
administração de LPS, a fim de obter um novo probiótico seguro com propriedade
neuromoduladora.

Justificativa

A Hanseniaspora uvarum PIT001 é um fungo ascomiceto encontrado em frutas, principalmente em uvas, e possui um importante papel na vinicultura, realizando a fermentação primaria das uvas em vinho (TRISTEZZA et al., 2016). Essa levedura também é de interesse agrícola, uma vez que pode ser usada como controle biológico contra uma diversidade de fungos, como a Colletotrichum capsici em chili e a Botrytis cinérea em uvas (LIU et al., 2010). Em estudos recentes em submissão a revista promovidos pelo grupo de pesquisa em microbiologia do departamento de biotecnologia da UFPEL, a H. uvarum PIT001 testou negativa para a atividade enzimática da gelatinase e proteolítica, duas enzimas importantes no mecanismo de patogenicidade de diversos microrganismos. Nesses estudos a H. uvarum PIT001 também inibiu o crescimento da Staphylococcus aureus, uma bactéria patogénica Gram-positiva que causa infecções simples até quadros de pneumonia e meningite (TONG et al., 2015), da Listeria monocytogenes, causadora da listeriose que pode provocar encefalites, meningites e abortos (MATLE et al., 2020) , da Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria patogénica oportunista presente em muitas infecções hospitalares (MEDEIROS FILHO et al., 2019), da Escherichia coli, capaz de modificar a microbiota intestinal e causar casos de diarreias severas (GOMES et al., 2016), e da Klebsiella sp, que causa pneumonia, infeções no trato urinário e sepse (BENGOECHEA et al., 2019). Foi investigado se a levedura seria capaz de sobreviver no trato gastrointestinal com soluções que simulam este ambiente, sendo a H. uvarum PIT001 capaz de sobreviver o trato digestivo sem alterações, e da solução pancreática, passando de 108 CFU/mL to 107 CFU/mL. Também foi visto se haveria alterações na presença de ácidos láticos, pois bactérias ácidas lácticas que compreendem o trato gastrointestinal produzem ácidos orgânicos que podem afetar a viabilidade dos fungos (ZENG et al., 2019), e a presença de ácido lático não alterou a biomassa do fungo. Foi estudado também o mecanismo de auto-agregação da levedura. Esse mecanismo é necessário para adesão em células epiteliais, e dados acima de 80% são considerados como bons agregadores, e a H. uvarum PIT001 apresentou 99.99% a 37°C em cultivo. A European Food Safety Authority (eFsa) detém uma lista chamada presunção de segurança qualificada (QPS), a qual microrganismos pertencentes dessa lista não precisam passar por todas as etapas de segurança para ter o produto aprovado no mercado, e a H. uvarum PIT001 foi aprovada e atestada a segurança (EFSA BIOHAZ Panel, 2021). Não há casos de infecções alimentares com a H. uvarum PIT001, entretanto, em 2018 um estudo conduzido por JANKOWSKI et al. (2018) mostrou uma possível dermatite causada pela a H. uvarum. Isto será avaliado neste estudo no seu protocolo de segurança. A administração da H. uvarum PIT001 será pela via oral, e não entrará em contato com a pele externa. A depressão é um transtorno psiquiátrico mais debilitante do mundo de acordo com a organização mundial da saúde, com mais de 280 milhões de pessoas do mundo sendo afetadas (WHO, 2021). Por mais de 50 anos, os seus tratamentos constituem intervenções medicamentosas. Entretanto, esse modo de tratamento pode trazer diversos efeitos adversos como boca seca, dor de cabeça, e disfunção sexual (KHAWAM et al., 2006). Outro ponto, é que por ser um transtorno multifatorial, nem todos os pacientes respondem ao tratamento, e dos que respondem, cerca de 1/3 entra em ressubmissão em determinado momento (KOK et al., 2012). Desta maneira, encontrar novos modos de tratamento que possam tratar o transtorno da depressão e diminuir os sintomas depressivos são de extrema importância para esses pacientes. O eixo microbiota-intestino-cérebro é um eixo bidirecional entre o cérebro e o intestino e tem influência direta pela microbiota intestinal. A microbiota, formada por vírus, bactérias e fungos, vivem no intestino e ajudam a manter a homeostase corporal. Entre as funções, podemos citar: inibição de patógenos, competitividade espacial, atividade imunomoduladora, homeostase energética e produção de metabólitos (BARKO et al., 2018). Na produção de metabólitos, é possível modular o cérebro de duas formas principais. A primeira é através da inervação do nervo vago, o décimo nervo craniano do tipo parassimpático, que está conectado no sulco retro-olivar do cérebro e faz conexão com o intestino. Dessa maneira o nervo recebe diversas inervações do intestino e manda sinais e estímulos ao cérebro, capaz de controlar humor, resposta imune, resposta inflamatória e digestiva (BREIT et al., 2018). E a segunda é através da circulação sanguínea, onde compostos lipofílicos podem cruzar a barreira hematoencefálica, e compostos que não cruzam podem estimular células próximas da barreira que então enervam o cérebro (DANEMAN et al., 2015). Entre os estimuladores, existe um tratamento que possui efeito na via do nervo vago e estimulação periférica pela a circulação sanguínea: o uso de probióticos. Os probióticos são substâncias que quando ingeridas em quantidades adequadas, não causam danos ao organismo e trazem uma resposta benéfica (HILL et al., 2014). Para chegar ao trato gastrointestinal, é recomendando que seja administrado entre 107 -109 unidades formadoras de colônia por dia (MINELLI et al., 2008). Em 108 resultados significativos são encontrados (BIRMANN, PALOMA T. et al., 2021) , e por essa razão está será a dose utilizada nesse estudo. Nos últimos anos os tratamentos com probióticos tem se mostrado interessante por trazer uma abordagem mais natural utilizando microrganismos vivos para o tratamento de doenças e transtornos. Em especial, os psicobióticos são aqueles que modulam o comportamento e são estratégias para combater doenças e transtornos psiquiátricos, como a depressão (BIRMANN, P. T.; CASARIL, A. M.; et al., 2021) (DHALIWAL et al., 2018). Para ter esse efeito positivo, é de extrema importância que os probióticos não causem nenhum mal ao organismo, uma vez que certos microrganismos podem induzir respostas inflamatórias e causar uma neuroinflamação (COSSU et al., 2021). Em métodos de indução da depressão, a neuroinflamação é um modelo interessante. Em modelos de neuroinflamação, é possível estudar a resposta do sistema imune e estresse oxidativo gerado no processo, o qual acontece o aumento de espécies reativas e diminuição da defesa enzimática e não enzimática (LINDQVIST et al., 2017). Um dos meios de causar a inflamação é através de infeções bacterianas, e a administração intraperitoneal de lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, constituinte da membrana celular de bactérias Gram negativas, ativa o sistema imune fazendo-o entrar em um estado inflamatório (LI et al., 2021). Os probióticos possuem propriedades imunomodulatórias, diminuindo a inflamação do sistema imune e padrões inflamatórios e de estresse oxidativo (BIRMANN, P. T.; CASARIL, A. M.; PESARICO, A. P.; CABALLERO, P. S. et al., 2021; KAZEMI et al., 2019). Desta maneira, encontrar probióticos capazes de proteger o organismo contra a inflamação é uma estratégia interessante no combate da depressão.

Metodologia

Este projeto contará com 2 protocolos, sendo o primeiro para ver a sua segurança e propriedade probiótica, e o segundo para ver seu efeito antidepressivo e anti-inflamatório caso o protocolo 1 tenha resultados favoráveis. 1- 1- Protocolo de segurança e propriedade probiótica. Neste protocolo os camundongos Swiss machos de 3-4 semanas de 25-35g serão administrados com H. uvarum PIT001 na dose de 1x 108 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) durante 14 dias. No 15° dia serão submetidos a testes comportamentais do campo aberto, teste do da suspensão da cauda, teste do splash e teste do nado forçado, para avaliar o efeito probiótico tipo antidepressivo per se da administração da levedura. Após os testes, os animais serão eutanasiados por overdose de isoflurano e será realizado o deslocamento cervical para confirmação da morte. Após isso, será coletado hipocampo, córtex pré-frontal, intestino, rim, fígado e sangue para análises bioquímicas de estresse oxidativo e toxicidade. Com hipocampo, córtex pré-frontal, intestino, rim e fígado será avaliado os níveis de espécies reativas ao oxigênio, as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, a atividade da enzima catalase, superóxido dismutase e dosado as proteínas com Bradford. Com o intestino será avaliado ainda a histologia do tecido para ver se não houve nenhuma modificação após a administração. Com o sangue, será realizado o hemograma para ver a ativação do sistema imune, e será medido as enzimas hepáticas, a aspartato aminotransferase (AST) e a alanina aminotransferase (ALT), bem como marcadores de dano renal, creatinina e ureia. Para avaliações do sistema imune ou toxicidade do animal, também será avaliado a temperatura corporal diariamente e será medido o peso do camundongo no primeiro e último dia do experimento. Para garantir que seja utilizado o menor número de animais maximizar a utilização dos tecidos, os animais foram separados em grupo: Grupo 1 (roxo): Comportamento + ROS, TBARS, CAT, SOD + Bradford + hemograma – para o hipocampo, córtex pré-frontal, intestino, rim e fígado, será realizado os ensaios ROS, TBARS, CAT, SOD e Bradford que serão homogeneizados com o mesmo tampão (Tris/HCl). O sangue destes animais será utilizado no hemograma. Grupo 2 (vermelho): Comportamento + AST, ALT, ureia, creatinina, histologia do intestino – com o sangue destes animais será avaliado as enzimas renais e hepáticas para ver danos nos rins e no fígado. Com estes animais, também será coletado o intestino para analise da histologia. Os resultados serão analisados através do software GraphPad Prism por análise do teste do estudante t (Student’s t-test) sendo os valores de p definido em * p < 0,05; ** p < 0,01 *** p < 0,001 quando comparados ao controle. 2- Protocolo antidepressivo – prevenção da indução por LPS. Para avaliar a capacidade psicobiótica da administração da H. uvarum PIT001 na dose de 1x 108 UFC durante 14 dias serão utilizados camundongos Swiss machos de 3-4 a semanas e com 25-35g. No 15° será realizado a administração de LPS por 0,83 mg/Kg do peso do animal. Após 24 horas, no 16° dia, serão realizados os testes comportamentais do teste do campo aberto, do teste da suspensão da cauda, do splash test e do teste do nado forçado. Após os testes comportamentais, os animais serão eutanasiados por overdose de isoflurano e confirmada a morte com deslocamento cervical. Serão coletadas amostras do hipocampo, córtex pré-frontal e intestino e sangue. Para medir a atividade antioxidante da administração do probiótico, será realizado os testes bioquímicos do nível de espécies reativas ao oxigênio, níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, nível de óxido nítrico, e atividade enzimática da catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase, e dosado a proteína em Bradford do hipocampo, córtex pré-frontal, intestino e sangue. Para avaliar a capacidade anti-inflamatório do probiótico, será realizado o PCR de proteínas expressas no hipocampo, córtex pré-frontal e intestino: GAPDH, Caspase I, IDO, IL-4, TNF- A, NRLP3, IL-1B, TRL4, BDNF. Também será realizado análises destas estruturas em Western Blot, para analisar a expressão do GAPDH, AKT, pAKT, Creb, pCreb, e NFkB.rase. Ainda visando os 3Rs da experimentação animal para reduzir o número de animais do estudo e aproveitar o maior número de tecido possível, os animais foram separados nos seguintes grupos: Grupo 1 (roxo): Comportamento + ROS, TBARS, SOD + Bradford – será utilizado hipocampo, córtex pré-frontal e intestino todos no mesmo tampão (Tris/HCl), o sangue será utilizado nos ensaios do SOD. (vermelho) Comportamento + CAT, GPx, Bradford – será utilizado hipocampo, córtex préfrontal e intestino utilizando também o mesmo tampão (Tris/HCl), entretanto, foi necessário separar em dois grupos diferentes devido a necessidade de fazer 6 ensaios, não tendo tecido suficiente para todos. O sangue será utilizado nos ensaios da CAT e GPx. Grupo 3 (verde) Óxido Nítrico – o tampão utilizado será o TFK, sendo necessário uma eutanásia especifica para homogeneizar hipocampo, cortéx pré-frontal e intestino. Grupo 4 (laranja): PCR (- GAPDH - Caspase I - IDO - IL-4 - TNF- A - nrlp3 - IL-1B - TRL4 -BDNF) – Para medir as proteínas em PCR é realizado um protocolo de homogeneização especifico das amostras do hipocampo, cortéx pré-frontal e intestino. Grupo 5 (azul): WB (- GAPDH, -AKT, -PAKT, -CREB, -PCREB, -NFkB) - Para medir as proteínas em WB é realizado um protocolo de homogeneização especifico das amostras do hipocampo, cortéx préfrontal e intestino.

Indicadores, Metas e Resultados

- Avaliar se a administração da H. uvarum PIT001 durante 14 dias não causa nenhuma perda de
massa dos camundongos ou induz febre causando o aumento da temperatura corporal;
- Avaliar o efeito per se da administração da H. uvarum PIT001 em enzimas e biomarcadores do
estresse oxidativo nos testes do ROS, TBARS, Catalase e SOD, em hipocampo, córtex pré-frontal,
intestino, fígado e rins, e avaliar a quantidade proteica das amostras em Bradford;
- Avaliar a citotoxicidade da administração da H. uvarum PIT001 em hemograma, para ver a ativação
de células do sistema imune;
- Avaliar a citotoxicidade da administração da H. uvarum PIT001 na medição de enzimas hepáticas e
presença de biomarcadores de dano nos rins nos testes AST, ALT, ureia, creatinina
- Avaliar a citotoxicidade da administração da H. uvarum PIT001 na histologia do intestino para ver
alguma alteração celular.
- Avaliar a capacidade da administração da H. uvarum PIT001 em prevenir o comportamento tipo
depressivo em camundongos causados pela a administração de LPS pela via intraperitoneal nos
testes comportamentais do campo aberto, suspensão da cauda, Splash test e do nado forçado;
- Avaliar a capacidade da H. uvarum PIT001 em modular enzimas do sistema antioxidante e de
reverter danos do estresse oxidativo nos ensaios de ROS, TBARS, Catalase, SOD, GpX, NO em
hipocampo, córtex pré-frontal, intestino e sangue e avaliar a quantidade proteica das amostras em
Bradford;
- Avaliar os possíveis mecanismos anti-inflamatórios da H. uvarum PIT001 em PCR das proteínas:
GAPDH, Caspase I, IDO, IL-4, TNF-A, NRLP3, IL-1B, TRL4, BDNF;
- Avaliar os possíveis mecanismos anti-inflamatórios da H. uvarum PIT001 no Western Blot das
proteínas: GAPDH, AKT, pAKT, Creb, pCreb, NFkB;

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
AIRTON SINOTT CARVALHO
GIULIANA PETIZ ZUGNO
JENIFER FETTER
LUCIELLI SAVEGNAGO20
PALOMA TABORDA BIRMANN

Página gerada em 22/02/2024 10:56:54 (consulta levou 0.113833s)