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Lawsonia intracellularis, bactéria Gram negativa e intracelular obrigatória, é o agente etiológico da Enteropatia Proliferativa (EP), uma doença economicamente importante para a suinocultura. Esta pode se manifestar na forma aguda, caracterizada por diarreia sanguinolenta e rápido óbito dos animais (McORIST et al., 1995; VANNUCCI E GEBHART, 2014) ou ainda na forma crônica, caracterizada principalmente pela diminuição do crescimento do suíno e aumento da frequência de natimortos (McORIST et al., 1995; GUEDES et al., 2017).
A Enteropatia Proliferativa apresenta distribuição mundial e prevalência de 57 a 100% em todo o mundo (McORIST et al., 2003), causando uma perda econômica significativa na suinocultura (RESENDE et al., 2015; HOLTSKMP, 2020). Em países como Alemanha, Dinamarca, Espanha, Holanda e Reino Unido foram detectados em 90,3% de 144 animais a presença da bactéria nas amostras fecais (ARNOLD et al., 2019). Baseado em resultados de um caso-controle e vários estudos de desafio experimental, o valor estimado da perda decorrente da diminuição da produtividade causadas por ileíte na fase de terminação variaram de US$ 6,00 a 17,00 por animal comercializado (HOLTKAMP, 2019).
A infecção por Lawsonia intracellularis é caracterizada pelo aumento do número de macrófagos na mucosa e altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, aumentando a expressão de IL-8 e TNFα, que pode ser um mecanismo pelo qual o patógeno favorece a coinfecção por Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium, bactéria responsável por doenças de origem alimentar em todo o mundo (BELOEIL et al., 2014; KIRK et al., 2015; LEITE et al., 2019). Dessa forma a vacinação contra L. intracellularis também contribui para a diminuição das infecções causadas por Samonella Typhimurium (LEITE et al., 2018).
A vacinação é a melhor medida profilática contra a EP (VISSCHER et al., 2018; LEITE et al., 2018). Vacinas atenuadas e inativadas baseadas na célula de L. intracellularis estão disponíveis no mercado e são produzidas em larga escala com culturas de células em suspensão (ROERINK et al., 2018). Além da restrição por patente, a complexidade dos sistemas de cultura de células permissíveis à infecção e a dificuldade do cultivo da bactéria limitam a sua produção, pois torna o processo laborioso e custoso.
Uma vez que as vacinas comerciais também dificultam o diagnóstico diferencial de animais vacinados e infectados, é necessária uma nova estratégia de intervenção contra L. intracellularis para reduzir o ônus de doenças bacterianas entéricas durante a produção de suínos. Com isso, as vacinas recombinantes vêm ganhando destaque, pois visam suprir as limitações mencionadas uma vez que usam antígenos específicos e previamente selecionados. Em conjunto, existe a possibilidade de se adicionar adjuvantes e probióticos para aumentar a eficiência da resposta imune vacinal (TYMCIU et al., 2004; SANTOS et al., 2020). O hidróxido de alumínio é um adjuvante amplamente utilizado em vacinas, pois são conhecidos por serem seguros e eficazes com uma variedade de antígenos, além de fornecer estabilidade e manter a integridade estrutural da proteína (COLAPRICO et al., 2020).
O design do antígeno e a criação das vacinas veterinárias recombinantes tornaram-se ainda mais eficazes com o apoio da bioinformática. Os programas e ferramentas ágeis, práticas e eficazes, são comumente utilizados no refinamento, facilitando a seleção de epítopos imunogênicos e a otimização da estrutura de proteínas (SORIA-GUERRA et al., 2015). A bioinformática tem colaborado de forma a direcionar a escolha dos antígenos e construções a serem consideradas na avaliação da expressão e imunogenicidade, reduzindo o tempo de desenvolvimento de vacinas capazes de estimular a resposta imune apropriada em substituição a formulações constituídas por patógenos completos e/ou toxóides inteiros (SORIA-GUERRA et al., 2015).Ainda, o uso da nova tecnologia de vacinas permite o emprego de sistemas de expressão como Escherichia coli, na qual pode se utilizar cepas não patogênicas, bem caracterizada, capazes de produzir grandes concentrações de antígenos recombinantes com o uso de substratos baratos (HAYAT et al., 2018).
Desta maneira, diferentes estratégias podem ser adotadas para o desenvolvimento de versões recombinantes de proteínas de Lawsonia intracellularis. O projeto visa desenvolver uma vacina baseada em epítopos imunogênicos selecionados por ferramentas de bioinformática e obtidos em sistema de expressão heterólogo visando a proteção dos suínos contra EP.

Delineamento experimental

Inicialmente, foram selecionados diferentes fragmentos com potencial alvo vacinal contra L. intracellularis, levando em consideração a predição de epítopos de linfócitos B, presença de peptídeo sinal, estabilidade e hidrofobicidade. Além dos fragmentos individuais refinados com auxílio de ferramentas de bioinformática, a construção de versões recombinantes foi realizada visando facilitar o processo de produção vacinal. Uma vez que essas tecnologias permitem projetar antígenos que apresentam uma ampla gama de epítopos responsáveis por conferir imunidade celular e humoral e proporcionar a simplificação dos processos de produção (FERREIRA et al., 2016).
Dezoito genomas de Lawsonia intracellularis foram obtidos em formato GenBank a partir do NCBI com uso da ferramenta Datasets (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/). As sequências foram convertidas para formato GFF3 com uso do pacote BioPerl (https://bioperl.org/) e então processadas pela ferramenta Roary, executada com as configurações default, para identificação de grupos ortólogos entre as diferentes cepas, para separar os genes que pertencem ao genoma núcleo.
Com base no genoma do núcleo, foi realizada a anotação estrutural e funcional das proteínas codificadas a partir de sua sequência representativa, a fim de se identificar peptídeos sinais, hélices trans-membrana, estruturas de barril beta e localização celular com as ferramentas SignalP, TMHMM, TMBED e PSORT, respectivamente. Já a identificação de epítopos de célula B e MHC-I foi realizada com as ferramentas EpiDope, NetMHC (com modelos de MHC de suíno).
As contruções foram feitas com base nos epítopos contíguos conectados com glicina em epítopos de linfócitos B e MHC I. Esta sobreposição resultou em uma quimera de 76.30 kDa (Quimera 4) compostas por domínios relacionados à adesão e invasão bacteriana e epítopos de transmembrana. Para avaliar a diferença das porções antigênicas, a Quimera 4 foi dividida em três partes denomidas Quimera 1 (24,20 kDa), Quimera 2 (27.74 kDa) e Quimera 3 (24.08 kDa).


Obtenção e caracterização das proteínas recombinantes

Os plasmídeos sintéticos (pet/28a) contendo as sequências dos genes de interesse serão utilizados para transformar células competentes de Escherichia coli (BL21) Star. Após a transformação, as células recombinantes serão selecionadas em placa contendo o meio ágar Luria Bertani (LB) suplementado com Canamicina (Sigma Aldrich). Serão selecionadas colônias para utilização no pré inóculo em 15 ml de meio LB líquido com Canamicina, que será mantido em agitação por 12h a 37 °C. O pré inóculo será adicionado a um Erlenmeyer contendo 500 ml de LB e Canamicina, sendo incubado posteriormente sob agitação orbital à 37 °C até atingir a densidade optica (D.O.600 = 0,6 a 0,8). Ao chegar à fase logarítmica de crescimento, a indução da expressão será realizada pela adição de 1 mM de IPTG por 4 h a 37 °C. Após a confirmação da expressão, as proteínas recombinantes serão purificadas em coluna de cromatografia de afinidade ao níquel.
Em seguida, as amostras serão submetidas a SDS-PAGE 12% corados com Comassie blue a fim de avaliar a presença das frações que contém a proteínas. A confirmação da expressão será realizada através de Western-blot com o anticorpo monoclonal anti-histidina (Sigma-Aldrich). As proteínas serão quantificadas através de curva de albumina do soro bovino (BSA) em SDS-PAGE e pelo método de Bradford.
Posteriormente, as proteínas recombinantes serão testadas quanto à sua antigenicidade frente a soro de animais vacinados e de animais infectados naturalmente e artificialmente. A avaliação será realizada através de ELISA indireto e Western-blot.


Avaliação da resposta imune em camundongos

A imunogenicidade das vacinas experimentais será avaliada no modelo camundongo (Balb/c) disponibilizados pelo Biotério Central da UFPel (CEUA XXXX). Para isso, 60 camundongos serão divididos em 6 grupos experimentais: grupo 1. controle (solução salina adicionada de 10% de Al(OH)3; grupo 2. Quimera 1; grupo 3. Quimera 2; grupo 4. Quimera 3; grupo 5. Quimera 4; grupo 6. Vacina comercial. Os grupos das vacinas recombinantes receberão a respectiva proteína (100 µg) e hidróxido de alumínio (10%); enquanto o grupo controle receberá PBS e hidróxido de alumínio; e o grupo 6 apenas a vacina comercial (Enterisol Ileítes, Boering); todos os grupos receberão duas doses vacinais com intervalo de 21 dias em um volume final de 100 µl. Serão realizadas coletas de sangue por punção submandibular nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 35 e 42 do experimento (7 coletas de sangue por animal, ou seja, 420 coletas totais). A partir da obtenção do soro será caracterizada a resposta imune humoral. Após o término do experimento, no dia 42, os animais serão submetidos a eutanásia pelo uso da anestesia inalatória com agente isofluorano e será realizado o procedimento de esplenectomia, para posterior avaliação da resposta celular. Os dados obtidos serão analisados no software estatístico GraphPadPrism 8 (GraphPad Software, CA, USA).
A resposta imune humoral contra os antígenos recombinantes será avaliada através de ELISA indireto, na qual a concentração dos antígenos e diluição dos soros será determinada em ensaios de checkerboard. Posteriormente, serão quantificadas as imunoglobulinas IgA, IgM, IgG e seus isotipos. A partir da esplenectomia será extraído RNA total dos esplenócitos coletados de cada grupo, feito cDNA para a realização de qPCR para avaliação da resposta imune celular, onde será feito a quantificação da transcrição do mRNA das citocinas IL-4, IL-8. IL-17 e IFN-y. Os dados obtidos serão analisados no software estatístico GraphPadPrism 8 (GraphPad Software, CA, USA).


Caracterização da resposta imune em suínos

O potencial imunogênico da vacina recombinante contra Enteropatia Proliferativa será avaliado através da vacinação de suínos, uma vez que estes animais são os principais acometidos pela doença. A resposta imune humoral e celular será determinada, conforme descrito acima. Para avaliar a capacidade da vacina de induzir imunidade esterilizante será realizado a detecção de DNA de L. intracellularis em amostras fecais suínas pela amplificação do gene aspA por PCR (WILLEMS & REINER, 2010; WATTANAPHANSAK et al., 2010). Será utilizado também a citometria de fluxo para avaliar a resposta específica do antígeno, estimulando as células para estimar a produção de citocinas, proliferação, ativação, memória ou reconhecimento do antígeno por meio de multímeros de MHC (McKINNON, 2018).

Com intuito de identificar e produzir um alvo vacinal que proteja suínos contra a enteropatia proliferativa causada por L. intracellularis e a padronização para a produção do antígeno recombinante em larga escala, estima-se que a vacinação com a proteína recombinante tenha a capacidade de estimular resposta imune protetora e esterilizante em suínos.
Por isso, espera-se que:
• No final do projeto, tenha-se obtido uma vacina baseada na proteína
recombinante que proteja suínos contra a Enteropatia Proliferativa, e
desenvolvido assim, um produto de grande interesse para uso veterinário;
• Espera-se que esta informação gere dados para a elaboração de
uma patente;
• Espera-se uma produção científica de artigos publicados.