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A depressão é um transtorno mental frequente caracterizada por humor deprimido, perda de
interesse ou prazer, diminuição de energia, sentimento de culpa e fracasso, distúrbios de humor e
apetite e dificuldade de concentração. Em todo o mundo, estima-se que mais de 300 milhões de
pessoas, de todas as idades, sofram com esse transtorno como mostram os dados da organização
mundial da saúde (OMS). Cerca de 800 mil pessoas atentam contra a própria vida todos os anos,
grande parte desse número pode ser associado à depressão. Além disso, esta doença causa enormes
prejuízos econômicos, os quais foram estimados em mais de R$ 2 trilhões no mundo todo em 2010,
e esse custo deve mais do que dobrar nos próximos 20 anos (Annan, 2014). A compreensão da
neurobiologia da depressão teve origem com a descoberta das propriedades antidepressivas de
drogas que aumentam a neurotransmissão de monoaminas. A hipótese das monoaminas sugere
que este transtorno possa ser resultado da diminuição de neurotransmissores de monoaminas,
como serotonina e noradrenalina no SNC (Coppen, 1967). No entanto, considerando que apenas
um terço dos pacientes que sofrem de TDM alcançam remissão completa dos sintomas após um
único tratamento antidepressivo (Trivedi et al., 2006), pode-se deduzir que os mecanismos
neurobiológicos da depressão não podem ser explicados apenas por uma hipótese.
Nas últimas décadas, buscou-se identificar outros mecanismos envolvidos no transtorno
depressivo, dentre as diferentes teorias destaca-se a ligação entre o sistema imunológico e o SNC
(Buras et al., 2016). A neuroinflamação tem recebido atenção crescente devido estudos clínicos e
pré-clínicos demonstrarem que esta condição pode induzir um comportamento do tipo depressivo
(Raison et al., 2006). Além disso, numerosos estudos descreveram a existência de uma forte
associação entre depressão e marcadores periféricos de inflamação no sangue e no líquido
cefalorraquidiano, como (IL)-1β e IL-6.
A inflamação periférica pode induzir estados inflamatórios centrais, aumentando a produção de
citocinas pró-inflamatórias no SNC, que por sua vez, podem afetar uma série de processos no SNC,
incluindo neurotransmissão, metabolismo dos neurotransmissores e até neurogênese. A ligação
entre o cérebro e o sistema nervoso periférico torna o cérebro sensível às flutuações na homeostase
do sistema imunológico, implicando no desenvolvimento de vários transtornos, incluindo a
depressão (Haase et al., 2015).
Na busca por novos fármacos antidepressivos que possam melhorar a resposta terapêutica
obtida pela farmacologia tradicional, é importante considerar compostos com o potencial de agir
por mais de um mecanismos sobre a fisiopatologia da depressão. Neste sentindo a benzamida N-(3-
(fenilselenil)prop-2-in-1-ílica (SePB) se destaca, pois já demonstrou efeito do tipo antidepressivo
agudo em camundongos, mediado pelos receptores serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A/2C e 5-HT3
(Besckow et al., 2020 ).
Dessa forma, pela necessidade de desenvolver novas ferramentas farmacológicas para
depressão utilizando diferentes alvos terapêuticos, e considerando que o mecanismo da
neuroinflamação parece estar envolvido na patogênese da depressão, investigar a ação
farmacológica da SePB em um modelo pré-clínico de depressão induzida por LPS torna-se
relevante, bem como, elucidar os mecanismos deste possível efeito.

Protocolos experimentais
Depressão induzida por LPS
Neste projeto, a dose escolhida de LPS é de 0,83 mg/kg. Esta escolha foi baseada em estudos
anteriores que demonstraram a capacidade do LPS de induzir o comportamento depressivo em
camundongos, nesta dose (O'Connor et al., 2009; Domingues et al., 2018). O LPS será dissolvido em
solução salina (0,9%) e injetado intraperitonealmente (i.p.) no animal em um volume de 10 mL/kg
em todas as condições.
Modelos comportamentais
Baseado nas informações contidas na literatura sobre o modelo pré-clínico de depressão induzida
por LPS, os testes comportamentais mais realizados para avaliar o efeito do tipo antidepressivo de
novos compostos orgânicos são os testes nado forçado, suspensão da cauda e de borrifagem de
sacarose (TSC, TNF e TBS, respectivamente) (Spohr et al., 2020; Luduvico et al., 2020; Sabedra et al.,
2019). Além disso, será realizado o TCA para avaliação da atividade locomotora espontânea do
animal. Os animais serão divididos em 2 sets experimentais, no qual um set será destinado a análise
comportamental pelos testes de suspensão da cauda e borrifagem de sacarose e o outro set de
animais será avaliado o comportamento no TCA e no TNF.
Teste da suspensão da cauda (TSC)
O TSC com algumas modificações será realizado para mensurar o comportamento do animal
frente a uma situação de desespero, um dos sintomas da depressão (Steru et al., 1985). Cada
camundongo será suspenso individualmente 50 cm acima do chão com fita adesiva colocada a
aproximadamente 1 cm da ponta da cauda. O tempo de imobilidade nesta condição será registrado
durante os últimos 4 minutos de uma sessão de 6 minutos, no qual os dois primeiros minutos servirá
apenas para habituar o animal. A definição de imobilidade é a ausência de comportamento de fuga
apresentado pelo animal. Além disso, o observador, desconhecerá os camundongos dos diferentes
grupos de tratamento.

Teste do nado forçado (TNF)
O teste do nado forçado permite avaliar o comportamento do tipo antidepressivo em animais
através da análise do tempo de imobilidade, foi descrito originalmente por Porsolt et al. (1997) e
será realizado com algumas modificações (Sabedra et al., 2019). Os camundongos serão colocados
individualmente em um cilindro (10 cm de diâmetro por 25 cm de altura), contendo 19 cm de água
a uma temperatura de 25 ± 1 °C. O tempo total do teste é de 6 minutos, porém o tempo de
imobilidade será registrado apenas nos últimos 4 minutos, pois os 2 primeiros minutos serão
destinados a habituação do animal. Os animais serão considerados imóveis quando permanecerem
flutuando imóveis na água ou fizerem movimentos para manter o nariz acima da superfície da água.
O observador desconhecerá os camundongos dos diferentes grupos de tratamento.
Teste da borrifagem de sacarose (TBS)
O teste da borrifagem de sacarose (TBS) permite avaliar o comportamento de autocuidado como
comportamento motivacional de acordo com protocolo usado em outros trabalhos (Birmann et al.,
2020; Liu et al., 2018). Este método permite pulverizar uma solução de sacarose a 10% na camada
dorsal de camundongos em sua gaiola. Devido a viscosidade desta solução, a sacarose suja os pelos
dos camundongos e os animais iniciam o comportamento de limpeza. O tempo total do teste é de
5 minutos, e durante este intervalo será registrado o tempo de latência e o tempo total gasto na
limpeza. O observador desconhecerá os camundongos dos diferentes grupos de tratamento.
Teste do campo aberto (TCA)
A avaliação da atividade locomotora e exploratória dos camundongos será realizada por meio do
TCA a fim de descartar qualquer efeito de um possível déficit locomotor ou exploratório causado
pelo tratamento com o composto (Walsh; Cummins, 1976). Os camundongos serão colocados no
centro de uma caixa de madeira (30 cm × 30 cm × 15 cm) divididos em nove quadrados de áreas
iguais, e durante 4 min, serão avaliadas o número de quadrados cruzados (atividade locomotora) e
o número de elevações (atividade exploratória).
Parâmetros bioquímicos
Preparação da amostra
O hipocampo (HC) e o córtex pré-frontal (CPF) serão utilizados para avaliação dos padrões
bioquímicos de estresse oxidativo e neuroinflamação, bem como haverá coleta sanguínea para
determinação dos níveis plasmáticos de corticosterona. Dessa forma, o HP e o CPF de um set
experimental serão destinados à avaliação bioquímica do estresse oxidativo e o sangue será
utilizado para determinação dos níveis plasmáticos de corticosterona e as estruturas cerebrais (HP
e CPF) do outro set experimental serão utilizadas para avaliar o perfil dos mediadores inflamatórios
por determinação molecular.
As estruturas cerebrais do primeiro set experimental serão coletadas e homogeneizadas em 50
mM de Tris-HCl com ph de 7,4 (1:10, w/v). Os homogeneizados serão centrifugados a 3500 g durante
10 minutos em uma temperatura de 4 °C. O sobrenadante será destinado para a determinação dos
níveis de estresse oxidativo. O CPF e o HC do segundo set experimental serão imersos em trizol e
mantidos a uma temperatura de -80 °C para a realização da reação quantitativa em cadeia de
polimerase em tempo real (RT-PCR). A amostra sanguínea será obtida por punção cardíaca (primeiro
set experimental) e será transferida para tubos heparinizados. Após a centrifugação (10 min a 2500
g), o plasma será estocado a -80 °C para a determinação dos níveis de corticosterona.
Detecção de espécies reativas
A quantificação dos níveis de espécies reativas será determinada pela oxidação de dicloro-diidrofluoresceína diacetato (DCHF-DA) para 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente através de
espectrofluorimetria convencional. Resumidamente, a intensidade da fluorescência de DCF será
registrada a 520 nm e excitação em 488 nm em espectrofotômetro. Os valores serão expressos em
unidade (U) de fluorescência (Loetchutinat et al., 2005).
Avaliação da peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica no CPF e HC será mensurada pela formação de malondialdeído (MDA) pela
técnica de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Uma alíquota do sobrenadante
homogeneizado será incubado com 8,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 0,8% de ácido
tiobarbitúrico (TBA) e ácido acético/HCl (pH 3,4) a 95 °C por 1 hora. Os níveis de TBARS serão
mensurados por espectrofotometria em um comprimento de onda de 532 nm. Os resultados serão
expressos como nmol TBARS/g tecido (Ohkawa et al., 1979).
Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A medição da atividade da SOD baseia-se na capacidade desta enzima em inibir a autoxidação
da adrenalina dependente de superóxido. O ensaio será mensurado espectrofotometricamente a
480 nm e a atividade da SOD será expressa em U SOD/mg proteína (Misra et al, 1972).
Atividade da catalase (CAT)
O ensaio se baseia na capacidade antioxidante da enzima CAT em decompor peróxido de
hidrogênio (H2O2). A reação enzimática será mensurada ao adicionar uma alíquota de sobrenadante
e o substrato H2O2 a uma concentração de 0,3 mM em um meio contendo tampão fosfato (50 mM,
pH 7,0) a 240 nm. Os valores serão expressos em U CAT/mg proteína (Beers et al, 1952).
Determinação de proteína
A concentração proteica será determinada de acordo com Bradford (1976) ao método de usar a
albumina bovina sérica como padrão.
Níveis de corticosterona plasmática
A determinação dos níveis de corticosterona plasmática será realizada através de um ensaio
fluorimétrico, de acordo com Znker e Bernestein (1957). As amostras de plasma adequadamente
diluídas serão tratadas com clorofórmio misturado com ácido-etanol sulfúrico (7:3, v/v) e, na
sequência, serão extraídas diretamente com o clorofórmio. Para a remoção do solvente será
realizado o processo de aspiração e o reagente ácido-álcool será transferido para uma cubeta e será
determinado os níveis de corticosterona plasmática por fluorescência em um fluorímetro (247 nm
de excitação e 540 nm de onda de emissão). Os resultados serão expressos em ng/mL (Zenker;
Bernstein, 1958).
Extração do RNA mensageiro e expressão genética por qRT-PCR
O RNA mensageiro (mRNA) total será extraído do CPF e HC de camundongos usando o reagente
trizol (InvitrogenTM, Carlsbad, CA, Estados Unidos) seguido do tratamento com DNase através do kit
DNA-free® (Ambion ™, EUA) e quantificação de mRNA. A síntese de cDNA será realizada usando o
kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems ™, Reino Unido) de
acordo com o protocolo do fabricante. A amplificação acontecerá com o SYBR Green PCR (Applied
Biosystems, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante. Expressões gênicas serão
normalizadas usando gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como gene de referência e as
condições para a reação envolverão 95 °C por 15 s, 60 °C por 60 s e 72 °C por 30 s. O método 2ΔΔCT
(Limiar Comparativo Delta-Delta) será usado para normalizar a mudança de dobras na expressão
gênica (Casaril et al., 2019).
As sequências dos primes que serão utilizadas estão descritas a seguir: interleucina 1-beta (IL-1β;
fwd 5′-GCT GAA AGC TCT CCA CCT CAA TG-3′, rev 5'-TGT CGT TGC TTG GTT CTC CTT G -3′), fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-α; fwd 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3′, rev 5'-TGG GAG TAG
ACA AGG TAC AAC CC-3′), indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO; fwd 5′-AAT CAA AGC AAT CCC CAC TG3′, rev 5'-AAA AAC GTG TCT GGG TCC AC-3′), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; fwd 5′-
CCA TAA GGA CGC GGA CTT GTA C-3′, rev 5′-AGA CAT GTT TGC GGC ATC CAG G-3′), fator nuclear
kappa B (NF-κB: fwd 5′-GCT TTC GCA GGA GCA TTA AC-3′, rev 5'-CCG AAG CAG GAG CTA TCA AC-3′)
glicealdeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; fwd 5’-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′, rev 5'-
TGT AGA TGT TGT AGT TGA GGT CA-3′) (Casaril et al., 2019).

Espera-se com este projeto entender melhor o efeito do tipo antidepressivo da SePB, bem como seu mecanismo de ação, a fim de desenvolver uma nova alternativa terapêutica para a depressão. Os resultados desta pesquisa serão publicados em periódicos internacionais e em resumos de congressos da área. Além disso, o projeto visa a formação de recursos humanos qualificados.