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O setor da pecuária no Brasil possui um dos maiores rebanhos bovinos do mundo, 214,9 milhões de bovinos (IBGE, 2021). Em 2019 a pecuária de corte representou 8,5 % do PIB brasileiro, tendo um aumento de 2 % em relação ao ano de 2018 (ABIEC, 2020).
Devido aos avanços da pecuária e da demanda do mercado, os produtores estão investindo na padronização e qualidade do seu rebanho.
Neste setor produtivo, a exportação de animais vivos apresenta um significativo mercado ainda em expansão. Entre os anos de 2017 a 2019 o Brasil foi responsável pela exportação de aproximadamente 1,5 milhões de animais vivos, com média de peso de 306 kg, representando uma receita superior a um bilhão de dólares (MDIC, 2021). Neste mesmo período, o Rio Grande do Sul (RS) foi responsável por 22,9% deste volume, significando 358.366 animais exportados (MDIC, 2021). A modalidade já é consolidada no Rio Grande do Sul, que exporta para a Turquia e países árabes cerca de 120 mil animais por ano – média histórica de 1% do rebanho gaúcho de 12,7 milhões de cabeças (SEAPDR, 2019). Os países importadores, se destaca Egito, Emirados Árabes Unidos, Iraque, Jordânia e Turquia, sendo esta última responsável 85,3 % do rebanho exportado nos anos de 2017 a 2019 no RS (MDIC, 2021). Porém, para que estes animais sejam aptos a serem comercializados, alguns protocolos sanitários são exigidos pelo país importador conforme o seu Certificado Zoosanitário Internacional (CZI), sendo assim, as exportadoras devem seguir rigorosamente esses procedimentos. Dentre os testes requeridos por cada país importador, estão os diagnósticos de enfermidades como: Paratuberculose (PTB), Diarreia Viral Bovina (BVD), Leucose Enzoótica Bovina (LEB), Tuberculose e Brucelose. A paratuberculose (PTB), também denominada doença de Johne é uma doença contagiosa crônica do trato intestinal causada pela bactéria Mycobacterium avium, um agente intracelular obrigatório, ácido forte e gram positivo (VALENCIA et. al., 2018) e acomete principalmente os ruminantes. O modo de transmissão é através da via fecal oral, onde os microorganismos se dissemina através das fezes de animais infectados, principalmente ocorre esta infecção em situações de superlotação e condições sanitárias inadequadas e apresentando longos períodos de incubação (GILARDONI et al., 2016; BENAVIDES et al., 2016). A doença pode apresentar quadros clínicos como: diarreia, queda na produção e perda progressiva de peso e animais subclínicos não apresentam
sintomatologia clínica (SOUZA, 2018). O controle da PTB é baseado em teste de diagnósticos, para identificação de animais infectados, deve ser empregado com cautela, pois a sensibilidade dos testes no estágio inicial da infecção pode não ser suficiente para detecção. Entretanto, medidas como a vacinação, práticas de manejo, detecção precoce e eliminação dos animais portadores são estratégias indicadas no controle desta enfermidade (GILARDONI et al. 2016).
O vírus da diarreia viral bovina (BVDV), pertence à família Flaviviridae, gênero Pestivirus e pode ser classificado em três diferentes espécies: vírus da diarreia viral bovina 1 (Pestivirus A), vírus da diarreia viral bovina 2 (Pestivirus B) e HoBi-like pestivírus (Pestivirus H) (ICTV, 2021). Os animais que podem desenvolver está enfermidade são os bovinos, ovinos, caprinos suínos, búfalos, coelhos, alces, ilhamas e alpacas. Sendo que os possíveis reservatórios os ovinos, caprinos e suínos. O BVDV está amplamente distribuído no mundo, principalmente em países onde há expressiva produção bovina (RIDPATH et al., 2017). Sua transmissão ocorre principalmente por contato direto e indireto de animais, por fontes iatrogênicas e de maneira vertical. A infecção causada por este vírus é predominantemente subclínica, porém pode ser reconhecida em rebanho que estão em condições nutricionais adequadas, mas apresentam desempenhos reprodutivos diminuído. Por outro lado, rebanhos que não são imunes e que são infectados pelo vírus podem demonstrar formas
agudas e severas, podendo levar a morte dos animais (ALMEIDA et al., 2013). Os sinais clínicos podem se inespecíficos como febre, diarreias e queda na produção de leite ou mais evidentes, como erosões nas mucosas do aparelho digestivo, malformações
congênitas e o principal sinal clínico aborto. Entre as principais características do vírus, destaca-se a sua capacidade e estabelecer infecção persistente, os animais persistentes infectados (PI) (ALMEIDA et al., 2013).
A circulação do BVDV pode gerar prejuízos relacionados a reprodução, imunossupressão, teratogenia e nascimentos de animais PI (BACCILI et al., 2019). Programas de controle e erradicação do BVDV estão relacionados a identificação e eliminação de animal PI, medidas de biossegurança e estratégias de vigilância (BAUERMANN et al., 2012). No Brasil, medidas de controle e erradicação do BVDV de forma organizada não são empregadas e vários aspectos da epidemiologia do vírus permanece indeterminado. Ambas as enfermidades já foram descritas no Brasil e no estado do Rio Grande do Sul, sendo descritas nas mesorregiões. Devido à importância sanitária e econômica,
é imprescindível conhecer como ocorre a distribuição dessa enfermidade nas diferentes mesorregiões do RS. Considerando tais importância, será realizado um levantamento de resultados a partir dos diagnósticos de PTB e BVDV, através de exames sorológicos e
RT-PCR para determinação de animais persistentemente infectados (PI) para BVDV. Assim, o presente estudo se propõe a levantar achados epidemiológicos do estado do Rio Grande do Sul para determinar a soroprevalência de PTB, assim como a soroprevalência de animais potencialmente persistentemente infectados (PI) para BVDV (revelados pela presença de antígenos de BVDV no soro) em animais em quarentena destinados á exportação, entre os anos de 2019 a 2023.

Amostras:
Neste projeto, serão analisadas amostras de soro de bovinos, proveniente de Estabelecimentos de Pré-Embarque (EPEs), em regime de quarentena, situado no Rio Grande do Sul, as mesmas serão mapeadas conforme a origem dos animais no estado separando conforme as mesorregiões do RS, nos anos de 2019 a 2023, totalizando 35.530 amostras. Os animais coletados irão cumprir com os pré-requisitos do país importador que são: animais castrados, com idade a 12 a 24 meses, com peso em média de 200 a 250 kg e de raça europeia (Bos taurus taurus) juntamente com o Certificado Zoossanitário Internacional (CZI) de cada país importador. As amostras de soro serão encaminhadas para o Laboratório de Clínicas M & S, localizado em Pelotas, RS, as quais, serão identificadas e estocadas em microtubos
(eppendorf) a 4 ºC em amostras individuais e pools de 10 e de 50, para posteriormente serem processadas, do total destas amostras será realizado diagnóstico para as doenças: Paratuberculose (PTB) e Diarreia Viral Bovina (BVDB).

Diagnóstico de Paratuberculose - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) indireto :
O diagnóstico de PTB vai se dar pelo método de Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) indireto, que compreende na detecção de anticorpos presentes no soro. Para PTB será utilizado o teste comercial IDVET® (Paratuberculosis Indirect- screening test), seguindo as instruções do fabricante. As microplacas são sensibilizadas com o antígeno da PTB, então será adicionado 10µl do controle negativo no poço A1 e B1 e o controle positivo nos poços C1 e D1, se adiciona também 110 µl/poço de tampão de diluição 6, que tem por finalidade neutralizar as reações cruzadas, e em cada poço será adicionado 10 µl do soro a ser testado, o próximo passo é a incubação das placas por 45 ± 4 minutos a 21ºC ± 5ºC. Após será feito as lavagens das placas 3 vezes com solução de lavagem (tween). Posteriormente, é adicionado 100µl de conjugado IgG- peroxidade (HRP)(1x), o qual tem finalidade de fixar os anticorpos anti-MAP, formando o complexo, as placas então serão incubadas a 30±3 minutos a 21ºC ± 5ºC, após será removido o conjugado e realizado a lavagem 3x com tween. Será adicionado solução de substrato (100 µl/poço), incubado por 15 minutos a 37 ºC e após este tempo se adiciona-se a solução de stop para interromper a reação. Após estas etapas as placas de ELISA serão colocadas no aparelho de
espectrofotômetro, em que será obtido a densidade óptica (D.O), considerando amostras positivas as que apresentam uma D.A maior que a média obtida dos ambos controles. Pôde-se observar que os poços onde ocorreu reação antígeno-anticorpo apresentaram
uma coloração que varia de acordo com o substrato utilizado.

Teste BVD
Para o diagnóstico de BVD, será utilizado dois métodos: o testes de ELISA (BVD P80 Antigen Capture, ID.Vet) e Real Time PCR com transcrição reversa (qRT-PCR), por tratar-se de um vírus RNA. Nesse caso, o ELISA buscará na amostra sorológica não os anticorpos, mas a presença do próprio antígeno: mais especificamente, da proteína P80 presente no BVDV. E a qRT-PCR (Id Gene BVD/BD Triplex) foi realizada seguindo o protocolo do fabricante (ID.Vet), primeiramente será extraído o RNA e obtendo o DNA complementar (cDNA), para ser possível realizar o teste.

Análise estatística
Após obtenção dos resultados os dados serão planilhados no programa Microsoft Excel©. A seguir, será realizado uma comparação de dois grupos: animais positivos e negativos, assim, calculando a prevalência de cada doença. A fórmula básica para calcular a prevalência de uma doença é:Prevalência = (Número de casos da doença / Total da população em risco) x 100. Essa formula calcula a proporção de indivíduos na população que apresentam a doença em um determinado momento, sendo a mesma expressa em percentual. A comparação estatística entre os grupos será realizada por meio do teste Qui-Quadrado (p ≤ 0,05), e para as variáveis consideradas estatisticamente significativas.

Rastreabilidade e Mapeamento
Após o cálculo da prevalência de PTB e BVDV, será realizado a rastreabilidade dos casos positivos. Isto é o rastreio da origem dos animais que chegaram em cada EPE possibilitando a realização do mapeamento a partir do software QGIS©.

Tem-se como meta alcançar dados representativos sobre a soroprevalência de Paratuberculose e Diarreia Viral Bovina no Rio Grande do Sul, destacando as mesorregiões.