Nome do Projeto
Estudo epidemiológico e patológico de tuberculose bovina no sul do Rio Grande do Sul
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
24/08/2023 - 24/08/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa de evolução crônica, causada por bactérias do gênero Mycobacterium spp., pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium bovis, M. tuberculosis, M. africanum e M. microtti). O M. bovis é o agente causador da TB bovina, sendo responsável, também, por 5% a 10% dos casos de TB humana. Atualmente, no Brasil, o diagnóstico da TB bovina baseia-se no teste de tuberculinização e na observação de lesões macroscópicas durante a inspeção post mortem de animais submetidos ao abate sanitário ou de rotina. Entretanto, em muitos casos podem ocorrer diagnóstico falso positivos ou falso negativos, o que pode representar risco a saúde pública e/ou prejuízos econômicos para o segmento de carne bovina. Tendo em vista a necessidade de estabelecer um diagnóstico preciso de tuberculose bovina a presente proposta visa utilizar diferentes métodos diagnósticos para determinar os possíveis padrões de lesões macroscópicas e microscópicas, bem como, estabelecer as técnicas com maior especificidade e sensibilidade para diagnóstico de TB bovina. Além disso, o projeto objetiva determinar aspectos epidemiológicos da doença, em bovinos e humanos, na região sul do Rio Grande do Sul (RS). Para excução do projeto serão utilizadas amostras refrigeradas oriundas de abate de bovinos, sob inspeção municipal. As amostras serão classificadas quanto as características macroscópicas e histopatológicas, sendo posteriormente submetidas a técnicas diagnósticas complementares, tendo como finalidade determinar o diagnóstico como positivo ou negativo para TB. Após, os resultados das técnicas diagnósticas serão comparadas quanto a sensibilidade e especificidade. A análise epidemiológica da doença será baseada em um estudo retrospectivo dos casos de tuberculose bovina diagnosticados no Laboratório Regional de Diagnóstico, da Faculdade de Veterinária, da Universidade Federal de Pelotas (LRD/FV/UFPel), e de humanos obtidos no banco de dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN).

Objetivo Geral

Realizar um estudo epidemiológico e patológico da tuberculose bovina na região sul do Rio Grande do Sul, podendo assim mapear áreas endêmicas da enfermidade e determinar métodos diagnósticos que contribuam para chegar a um diagnóstico mais preciso.

Justificativa

O potencial zoonótico do M. bovis e os prejuízos econômicos que este acarreta para a pecuária fazem com que a tuberculose bovina continue sendo um importante alvo de estudos. A determinação das características epidemiológicas nas diferentes regiões do país é fundamental para uma real avaliação da situação da doença nos rebanhos bovinos, bem como, para avaliar possíveis relações do M. bovis com casos de tuberculose humana.
Embora as lesões de tuberculose apresentem características macroscópicas típicas, o diagnóstico baseado apenas no exame post mortem pode ser subjetivo, visto que, outras doenças podem cursar com lesões macroscópicas semelhantes e em alguns casos de tuberculose os animais podem não apresentar lesões características. Dessa forma, casos positivos podem entrar no mercado consumidor, sendo um risco para a saúde pública, e casos negativos podem ser condenados, ocorrendo prejuízos econômicos.
O Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LRD/FV/UFPel) atua em parceria com o serviço de inspeção municipal de Pelotas no diagnóstico de tuberculose bovina de lesões observadas durante o abate em animais clinicamente saudáveis. Muitas lesões encaminhadas para análise histopatológica não apresentam aspectos macroscópicos e/ou microscópicos característicos de tuberculose, sendo necessária a implementação de novas técnicas diagnósticas para reclassificar as lesões e os diferentes padrões macroscópicos e microscópicos que podem ser observados de acordo com o estágio de desenvolvimento da doença.

Metodologia

4.1 Coleta de dados e amostras utilizadas
Animais: Será realizado um levantamento dos casos de tuberculose bovina no banco de dados do serviço de inspeção municipal de pelotas. Serão tabuladas as informações de idade, sexo, raça e procedência dos animais, bem como, a forma de diagnóstico.

Humanos: A tuberculose é uma doença de notificação compulsória e está presente na Lista Nacional de Notificação Compulsória de Doenças, Agravos e Eventos de Saúde Pública, unificada pela Portaria nº 1061 de 18 de maio de 2020, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2020). Assim, serão utilizados dados sobre a ocorrência dessa enfermidade gerado na rotina dos sistemas de vigilância e controle do agravo no Brasil.
Por ser uma doença de notificação compulsória, sua suspeita ou ocorrência gera preenchimento da ficha de notificação pelo profissional responsável na secretaria municipal ou estadual de saúde. Nessa ficha constam informações sobre a ocorrência da enfermidade em questão, além de gênero, escolaridade, idade, atividade profissional, ocorrência e data do óbito, data dos primeiros sintomas, tipo de entrada (caso novo, recidiva), forma de apresentação do agravo (pulmonar, extrapulmonar, pulmonar + extrapulmonar) e diagnóstico utilizado (baciloscopia e teste de sensibilidade). Após o preenchimento, essas informações são digitalizadas e passadas para o sistema de informação de agravos de notificação (SINAN), que será, por sua vez, utilizado para a construção dos bancos de dados a serem utilizados na presente pesquisa. O acesso e download do banco será feito através do site do Ministério da saúde no portal SINAN de tuberculose. Salienta-se que a utilização desses bancos de dados será exclusivamente no âmbito da presente pesquisa.

Amostras de abate: Serão utilizadas amostras de tecido com lesões sugestivas de tuberculose, encaminhadas a fresco pelo serviço de inspeção municipal de Pelotas-RS ao LRD/FV/UFPel. Serão analisadas, também, amostras de tecido obtidas durante abate sanitário de bovinos positivos para tuberculose nos testes tuberculínicos.

6.1 Análises
Histopatológica: Todas as amostras, incluindo as do arquivo do LRD, serão avaliadas microscopicamente nas colorações de Hematoxilina e Eosina e Ziehl Neelsen (ZN). Em cada caso será determinado o grau de necrose caseosa, calcificação distrófica, tipo de infiltrado inflamatório e presença de bacilos álcool-ácido-resistentes na coloração de especial de ZN.

Imunohistoquímica: Cortes selecionados, de todos os casos com lesões histológicas compatíveis com tuberculose, serão colhidos em lâminas positivas e submetidos a técnica de imunohistoquímica pelo método estreptavidina ligada à peroxidase. Para imunomarcação de bactérias do gênero Mycobacterium, complexo Mycobacterium tuberculosis, será utilizado o anticorpo primário anti-mycobacterium tuberculosis (GeneTex, GTX20905), na diluição de 1:200. A recuperação antigênica será realizada com protease XIV por 15’ em temperatura ambiente. As imunomarcações serão visualizadas através da utilização do cromógeno 3’3 diaminabenzidina (DAB). As lâminas serão contra-coradas com hematoxilina de Harris e montadas em entelan.

Isolamento bacteriano: O isolamento de micobacterias será realizado em laboratório parceiro nível três. As amostras teciduais serão descongeladas, homogeneizadas e descontaminadas, de acordo com os métodos utilizados pelo laboratório. O cultivo será realizado nos meios Löwenstein-Jensen e Stonebrink-Lesslie. As culturas serão incubadas a 37°C por um período mínimo de 90 dias. Esfregaços das colônias serão corados pela técnica de Ziehl­Neelsen, para observação de bacilos álcool-ácido-resistentes.

Análise estatística
o Estatística descritiva
Os dados referentes a idade, sexo e raça dos animais serão analisados, tendo como finalidade estabelecer o perfil dos animais acometidos. As informações referentes a origem dos animais serão utilizadas para verificar a distribuição da doença nos municípios da microrregião de Pelotas.

o Hotspot espaço-temporal
Serão realizadas análises espaciais por área, considerando a unidade de agregação municipal, para os casos de tuberculose bovina. Assim, serão inicialmente construídos mapas temáticos anuais referentes a distribuição das enfermidades nos municípios da região sul do Rio Grande do Sul.
A análise de hotspot, que identifica tendências no agrupamento potencial de densidades de casos (contagens) ou focos, será realizada para detectar quaisquer padrões espaço-temporais existentes. A estatística Getis-Ord Gi será aplicada para cada variável no conjunto de dados. As pontuações z e os valores P resultantes descrevem se os conglomerados são de muitos ou poucos casos/valores. Nessa análise, a soma local de uma variável no município e nos de seus vizinhos é comparada proporcionalmente à soma em todos os municípios. Quando a soma local é muito diferente da soma local esperada e quando essa diferença é muito grande para ser aleatória, resulta em um escore z significativo. A correção da taxa de descoberta falsa será aplicada ajustando a significância para levar em conta vários testes e a dependência espacial. Um escore z acima de 1,96 ou abaixo de -1,96 indica um hotspot significativo ou um coldspot significativo no nível de significância de P <0,05 (HARRIS et al., 2017).
Para testar se existe uma tendência temporal significativa por meio da série temporal de escores z de cada compartimento resultante da estatística Getis-Ord Gi, será aplicado o teste de tendência de Mann-Kendall (HARRIS et al., 2017). Esta é uma análise de correlação de classificação para a contagem de posições e sua sequência de tempo. O valor do compartimento para o primeiro período é comparado ao valor do compartimento para o segundo período. Se o primeiro for menor que o segundo, o resultado será +1; no caso inverso, -1; e se os dois valores forem iguais, o resultado será zero, um resultado que indicaria ausência de qualquer tendência ao longo do tempo. Com base na variação para os valores na série temporal do compartimento, o número de empates e o número de períodos, a soma observada é comparada à soma esperada (zero) para determinar se a diferença é estatisticamente significativa ou não. O sinal associado ao escore z determina se a tendência é um aumento (escore z positivo) ou uma diminuição (escore z negativo) dos valores da variável ao longo do tempo (ESRI, 2016). Com o z-score do hot spot e o valor P, a ferramenta de análise do hotspot caracterizará os municípios em diferentes categorias, de acordo com o padrão de desenvolvimento das epidemias em cada município (ANNO et al., 2019).

o Teste Kappa
Um dos principais critérios para avaliação da qualidade de um instrumento é a sua confiabilidade e esta pode ser considerada maior quando, em repetidas mensurações de um atributo, se obtiver uma menor variação. Existem várias formas para estimativa da confiabilidade. A confiabilidade interavaliadores (interrater reliability), possibilita a verificação do grau de correspondência de resultado entre as avaliações independentes de dois ou mais diagnósticos, utilizando o mesmo instrumento de classificação.
A estimativa da confiabilidade e da validade de um instrumento para classificação de teste diagnóstico pode ser determinada quando: um novo sistema está sendo desenvolvido; após sua implementação, em intervalos regulares, para monitorar o seu correto uso; ou ainda quando um sistema existente é modificado para se adaptar às novas exigências do serviço ou para ser utilizado em outro local.
O Coeficiente Kappa pode ser definido como uma medida de associação usada para descrever e testar o grau de concordância (confiabilidade e precisão) na classificação (13). Landis; Koch(15) caracterizaram diferentes faixas para os valores kappa, segundo o grau de concordância que eles sugerem. Assim valores maiores que 0,75 representam excelente concordância. Valores abaixo de 0,40 representam baixa concordância e valores situados entre 0,40 e 0,75 representam concordância mediana.

O índice kappa é estimado como:
k=(Po-Pe)/(1-Pe)
sendo:
Po = Proporção de concordâncias observadas
Pe = Proporção de concordâncias esperadas

o Tendência e sazonalidade
A série temporal pode ser decomposta na soma Yt = Tt + St + at, em que a tendência (Tt) refere-se ao aumento ou diminuição das observações ao longo de um período; a sazonalidade (St) mostra flutuações ocorridas em períodos menores que um ano e a componente aleatória ou erro (at) mostra as oscilações aleatórias irregulares (MORETTIN & TOLOI, 2006).
Ao avaliar a incidência da tuberculose através de uma série mensal é possível encontrar diversos fatores aleatórios, tais como: alterações sanitárias, mudanças nas políticas de saúde, dentre outros. Estes fatores são conhecidos dentro do modelo como ruído branco, pois são elementos aleatórios que ocorrem devido ao acaso. Não possuem relação com as variações cíclicas ou com a tendência.
Dessa forma, a análise do correlograma será realizada para verificar se as séries apresentam componentes de tendência e sazonalidade. Sendo verificada a existência desses componentes, para cada enfermidade, as séries serão diferenciadas e, posteriormente, testadas estatisticamente em relação a existência da estacionariedade por meio de testes de Dickey-Fuller aumentado (DICKEY & FULLER, 1979), considerando um valor de p<0,05 (MORETTIN & TOLOI, 2006). Uma vez observada estacionariedade nas séries diferenciadas, será inferida a presença ou ausência dos componentes tendência e sazonalidade nas séries mensais consideradas. Serão realizados os cálculos de modelos de mínimos quadrados ordinários (MQO) para estimar a tendência estatisticamente significativa (p<0,05), e o cálculo do coeficiente de determinação (R2) nas séries temporais dos indicadores ao longo do tempo (BRUHN et al., 2018).

o Correlação
É um método estatístico que mede o grau de associação entre duas variáveis, quantitativas, aleatórias X e Y sem a definição de qual é independente ou dependente. Essa anál

Indicadores, Metas e Resultados

Através da metodologia aqui proposta, espera-se com este projeto:
- Mapear as propriedades foco de tuberculose bovina, na região sul do Rio Grande do Sul.
- Estabelecer os principais sítios e características macroscópicas das lesões de tuberculose em bovinos.
- Identificar as espécies envolvidas no desenvolvimento das lesões em bovinos.
- Determinar a eficiência das diferentes técnicas no diagnóstico de tuberculose bovina.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA LUCIA PEREIRA SCHILD2
CAROLINA GONCALVES DE SOUSA
ELIZA SIMONE VIEGAS SALLIS10
FABIANO DA ROSA VENANCIO
JOSIANE BONEL2
MARGARIDA BUSS RAFFI2
MARTA SANTOS DE MORAES
TÁINA DOS SANTOS ALBERTI

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