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A esporotricose é uma enfermidade fúngica causada por espécies dimórficas do gênero Sporothrix (Marimon et al., 2007), e que infectam os mamíferos, como humanos (Fischman et al., 2016; Vettorato et al., 2018) e animais (Montenegro et al., 2014; Gremião et al., 2017; Sanchotene et al., 2015; Nakasu et al., 2020), são referentes ao Sporothrix schenckii sensu stricto, S. brasiliensis, S. globosa e S. luriei, ao passo que S. mexicana pertence ao clado ambiental (Rodrigues et al., 2020).
A micose é transmitida através de inoculação cutânea traumática de fômites contaminados com os conídios fúngicos, como espinhos de plantas, matéria em decomposição, solo, entre outras fontes ambientais, os quais correspondem à principal via de transmissão da doença na maioria dos países do mundo (De Araújo et al., 2015; Govender et al., 2015; Zhao et al., 2017). No Brasil, essa via clássica é relatada esporadicamente (De Araújo, et al., 2015), ao passo que a via zoonótica, através de mordidas e arranhaduras de animais doentes, especialmente felinos, constitui a principal via de transmissão da esporotricose para animais e para o homem (Madrid et al., 2012; Rodrigues et al., 2016). De acordo com Silva e colegas (2012), dos 804 casos em humanos diganosticados entre 2005 e 2008, pelo INI/Fiocruz , 91% dos humanos tinham contato próximo de felinos, sendo que 68% relataram arranhaduras e/ou mordeduras provocadas por felinos. Adicionalmente, a esporotricose causada por S. brasiliensis tornou-se um grande problema de saúde pública, por ser uma espécie emergente e que se espalha facilmente entre as populações de gatos (Rossow et al., 2020), além do agente apresentar elevada capacidade de virulência (Rodrigues et al., 2013).
O primeiro caso de esporotricose em humanos, envolvendo transmissão felina, foi descrito nos Estados Unidos em 1952 (SINGER; MUNCIE, 1952). No Brasil, a esporotricose zoonótica por transmissão felina foi descrita alguns anos depois em São Paulo (ALMEIDA et al., 1955). No final dos anos 1980, a esporotricose zoonótica no Brasil voltou a ter destaque com a publicação de casos de São Paulo envolvendo felinos na transmissão (LARSSON et al., 1989). Desde a década de 1990, vários outros casos foram descritos, especialmente nas regiões Sul e Sudeste (MARQUES et al., 1993; NOGUEIRA et al., 1995; NOBRE et al. 2001; XAVIER et al. 2004; MEINERZ et al. 2007; MADRID et al. 2010; POESTER et al. 2018; MASCHIO-LIMA T. et al., 2021).
Atualmente, a esporotricose é a principal zoonose fúngica em expansão no País, sendo negligenciada, e tendo principal ocorrência no Rio de Janeiro, onde, nas duas últimas décadas, foi registrada em 4.703 felinos, 4.188 humanos e 244 caninos pela Fundação Oswaldo Cruz (Gremião et al., 2017). Os demais Estados também vêm registrando casos anuais, tais como São Paulo (Montenegro et al., 2014), Minas Gerais (Stopiglia et al., 2014), Pernambuco (Valeriano et al., 2020), Distrito Federal (Eudes Filho et al., 2020) e, principalmente, Rio Grande do Sul (Madrid et al., 2012; Sanchotene et al., 2015; Waller et al., 2018, Poester et al., 2018, Nakasu et al., 2020), considerado o segundo Estado Brasileiro em alerta de epidemia, cujos municípios de Pelotas e Rio Grande são endêmicos com crescentes registros de transmissão zoonótica.
No que concerne o tratamento, falhas terapêuticas têm sido relatadas em diferentes apresentações comerciais do princípio ativo, incluindo fármacos industrializados e manipulados. Estudos in vitro têm sustentado o surgimento de cepas de Sporothrix spp. resistentes aos antifúngicos, inclusive ao itraconazol. Ainda, há escassez de estudos in vitro e ensaios clínicos que certifiquem essa observação. A resistência antifúngica de patógenos do complexo Sporothrix schenckii tem sido reportada frente a diversos antifúngicos, destacando-se isolados de Sporothrix brasiliensis de felinos e caninos com esporotricose no Rio Grande do Sul, os quais já foram descritos como resistentes ao itraconazol. No entanto, o itraconazol faz parte dos antifúngicos preconizados para o tratamento da esporotricose humana, seguido do iodeto de potássio, terbinafina e o complexo lipídico de anfotericina B (formas graves e disseminadas) (ministério da saúde- sitio eletrônico nas referências). De acordo com Santos e colaboradores (2019), dos 106 atendimentos de antifúngicos para tratamento dos pacientes com esporotricose no Brasil, de 2014 a 2019, destes, 58,5% utilizaram o itraconazol do estoque estratégico do Ministério da Saúde. Portanto, é patente a necessidade de inovação farmacológica em relação a novos fármacos antifúngicos, em especial, para o tratamento de enfermidades como a esporotricose. De forma que, os metalofármacos surgem como uma nova possibilidade terapêutica. Pois, nos últimos anos, o que se observa é um crescimento vertiginoso nos casos de resistência aos antifúngicos, em uma taxa em que o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos não tem acompanhado. Diante disso, é necessário desenvolver novos antifungicos, de preferência com novos mecanismos de ação, que não sejam reconhecidos pelos fungos, e é justamente este fato que tem feito com que a química bioinorgânica e química medicinal tomem grandes proporções na atualidade.
Buscando encontrar terapias que sejam eficientes para as mais diversas ocorrências inflamatórias, infecciosas, e para contornar a ineficiência dos tratamentos convencionais e a forma de resistência dos microrganismos pelos fármacos, pesquisadores têm se dedicado ao estudo de novos metalofármacos.
É amplamente conhecido que os íons metálicos desempenham um papel essencial tanto no crescimento, como no metabolismo de sistemas vivos. Inúmeras atividades biológicas exercidas por íons metálicos têm estimulado o desenvolvimento de fármacos à base de metais. Compostos inorgânicos, já são ministrados contra algumas enfermidades, podendo citar o Tiresenox (óxido de arsênio(II)) com uso clínico no tratamento do câncer; o Auranofin (artrite); Fosrenol (Carbonato de Lantânio) em Hiperfosfatemia em doentes renais; Camcolit (Carbonato de Lítio) no tratamento da depressão; Na₂[Fe(CN)₅NO]·2H₂O, um potente vaso dilatador, fonte de óxido nítrico (hipertensão) [ ]. Outros exemplos importantes são os complexos de gadolínio(III) [ ], utilizados como agentes de contraste em ressonância magnética e os de tecnécio-99, usados na obtenção de imagens cardiovasculares [ ].
Pesquisas recentes em microbiologia começaram a se concentrar em complexos de cobre. O efeito biocida do cobre em uma ampla gama de patógenos, como bactérias, fungos e vírus, tem sido demonstrado por muitos estudos ( ). Em contraste com o efeito antibacteriano, a capacidade antifúngica do cobre não tem sido amplamente explorada. Weaver et ai. estudou a eficácia do cobre contra vários fungos (Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium chrysogenum e Candida albicans) ( )., verificando que o cobre foi capaz de matar todos os fungos, exceto Aspergillus niger. Além disso, o cobre foi capaz de impedir a germinação de esporos de fungos. O mecanismo por quais os fungos são mortos empregando cobre foi encontrado ser semelhante ao mecanismo pelos quais atuam em bactérias [ ]. Quaranta et al. descobriram que o efeito antifúngico começa com extenso dano da membrana fúngica, que foi seguido por alargamento e desaparecimento de vacúolos e estresse oxidativo ( ).
O mecanismo pelo qual o cobre mata os microrganismos é multifacetado e ainda não totalmente entendido. A literatura sugere que o cobre interage com microrganismos em diferentes níveis celulares, todos resultando em morte celular, incluindo permeabilização da membrana celular, peroxidação lipídica da membrana, alteração de proteínas e desnaturação de ácidos nucleicos. (X) Os íons de cobre liberados da superfície são transportados através da membrana celular através de um sistema de transporte dependente de energia. Uma função de barreira diminuída do plasma membrana ocorre ao atingir uma concentração intracelular crucial de íons de cobre. A membrana torna-se cada vez mais permeável, levando ao vazamento do conteúdo celular vital tais como nucleotídeos, aminoácidos e potássio (62, 63); Warnes et ai. (64) demonstrado rápida despolarização da membrana e perda de integridade da membrana após a exposição a metais superfícies de cobre, levando ao acúmulo citoplasmático de radicais livres. Outro mecanismo pelo qual o cobre danifica a membrana celular é através da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os íons de cobre são capazes de doar e aceitar elétrons e, portanto, podem mudar entre Cu(I) e Cu(II) via oxidação. Isso catalisa a formação de ROS como radicais hidroxila (HO) e ânions superóxido (O2); causa estresse oxidativo aos lipídios da membrana (peroxidação lipídica), aminoácidos nas proteínas,e ácidos nucleicos; e causa a desativação oxidativa de enzimas (27, 63-69).
Bases de Schiff são uma importante classe de compostos orgânicos. Sendo interessantes por apresentarem elevada atividade biológica, atuando como inibidora da lipoxigenase, antiinframatória, anticâncer, antibacteriana e antifúngica.[ ] Espera-se que, através da variação de alguns parâmetros estruturais e esteroeletrônicos das moléculas, complexos metálicos com melhores propriedades farmacológicas possam ser descobertos para aplicação como agentes antimicrobianos, seja de forma isolada ou combinada com medicamentos em uso clínico. A aprovação desta proposta irá consolidar o desenvolvimento de trabalhos interdisciplinares entre as diferentes áreas envolvidas no projeto. Prevê-se a ampliação deste trabalho com outras classes de ligantes, centros metálicos e esferas de coordenação.

. Síntese e caracterização de compostos orgânicos (pré-ligantes) e de complexos de Cu(II)
O planejamento, síntese e caracterização dos compostos orgânicos e inorgânicos será realizada pelo grupo de pesquisa da Dra. Adriana Pinheiro. O grupo conta com alunos de doutorado, de mestrado e alunos de iniciação científica. O parque instrumental do CCQFA dispõe de cromatógrafo a gás com detecção espectrométrica de massas GC-MS-QP2010 Plus; espectrômetro de ressonância magnética nuclear Varian Inova 400 MHz, espectrofotômetro UV-Visível Lambda 25/PERKN ELMER, Espectrofotômetro IR Affinity-1 Shimadzu, entre outros.
A síntese dos pré-ligantes Bases de Schiff (compostos orgânicos) (Esquema 1) segue por modificações descritas na literatura,[ ] em que a amina primária (precursora A) será condensada com um aldeído aromático (B) para a formação de uma imina (C).
Os procedimentos de síntese dos complexos serão seguidos através de rotas convencionais descritas na literatura, com os necessários ajustes de acordo com a natureza do ligante (solubilidade, estado físico, estabilidade termodinâmica, pKa, etc). Partiremos de diferentes sais de Cu(II) [CuCl2.2H2O, Cu(NO3)2, Cu(OAC)2.H2O, Cu(ClO4)2] para complexação com os ligantes previamente sintetizados (compostos orgânicos), os quais permitirão diferentes esferas de coordenação e reatividade. As reações envolvendo a síntese dos complexos contendo esses ligantes serão em geral conduzidas sem controle de atmosfera inerte. Os ligantes e complexos serão caracterizados por espectroscopia na região do IV, UV-Vis, RMN (1H, 13C), análise elementar (CHN) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) utilizando os equipamentos disponíveis na Universidade Federal de Pelotas e Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Estudos estruturais por difração de raios X de monocristal serão realizados na Universidade Federal de Santa Maria. Além disso, serão realizados estudos eletroquímicos por voltametria cíclica.

No Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária (MicVet), da Faculdade de Veterinária, da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL, Pelotas/RS, Brasil) serão realizados os testes referentes à suscetibilidade antifúngica, avaliação qualitativa do mecanismo de ação. Salienta-se que o laboratório de micologia é referência no diagnóstico de esporotricose felina e canina no sul do Estado do Rio Grande do Sul, e possui adequada estrutura laboratorial para a execução dos experimentos, tais como estufas, fluxo de capela laminar de biossegurança do tipo II, meios de cultura, e diversos utensílios de utilidade laboratorial.
Desta forma, a pesquisa conta com 30 isolados clínicos de Sporothrix brasiliensis de origem felina (n: 15) e canina (n: 15) com esporotricose e que se encontram atualmente estocados em meios de cultura Potato-dextrose agar (PDA) na micoteca do Centro de Diagnóstico em Micologia Veterinária (UFPEL, Pelotas/RS, Brasil) serão utilizados. A região geográfica de estudo é conhecida nacionalmente por seus crescentes casos de esporotricose humana e animal diagnosticados pelos laboratórios regionais, sendo o laboratório citado reconhecido como referência no diagnóstico da esporotricose animal. Os animais doentes eram residentes de oito cidades no sul do Estado do RS (Canguçu, Capão do Leão, Cerrito, Morro Redondo, Pedro Osório, Pelotas, Rio Grande e São Lourenço do Sul) entre 2007 e 2019, e foram todos previamente diagnosticados por identificação macroscópica e microscópica (exame direto e cultivo celular) como Sporothrix spp., sendo posteriormente confirmada a espécie fúngica como S. brasiliensis por meio de identificação molecular do DNA genômico, utilizando os locus calmodulina (CAL) e espaçador transcrito interno (ITS).
Como controle, serão utilizados pelo menos uma cepa-padrão das espécies S. brasiliensis, S. schenckii e S. globosa, ambos de origem humana, bem como de S. mexicana de origem ambiental. Todas as cepas-padrões citados já foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Micologia Médica e Molecular, da Universidade de São Paulo (USP) e encontram-se estocadas no Centro de Diagnóstico em Micologia Veterinária, da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL, Pelotas/RS, Brasil). Dessa forma, os isolados clínicos de S. brasiliensis serão submetidos aos testes de suscetibilidade in vitro frente ao fármaco itraconazol e aos metalofármacos, cujos detalhes encontram-se a seguir.

Testes Toxicológicos

Os testes toxicológicos agudos serão realizados através da metodologia Fish Embryo Acute Toxicity - FET (OEDC, 2013) utilizando o modelo zebrafish. Os ensaios iniciarão logo após a fertilização dos ovos, até um período máximo de 90h. Inicialmente, uma desova de zebrafish será avaliada sob microscópio estereoscópico para seleção da viabilidade dos ovos, identificados através da presença de disco germinal e pela transparência. Uma quantidade suficiente de ovos será submetida a quatro diferentes concentrações do analito que será analisado, além de controle negativo (água tamponada), e controle positivo (solução de 4,0 mg/L de 3,4-Dicloroanilina). Os ovos serão então transferidos para microplacas, contendo as concentrações analisadas, e serão mantidas em incubadora à 26 C e fotoperíodo de 12/12. Os embriões serão observados em intervalos de 24h pós fertilização (hpf), tendo como métrica os seguintes parâmetros: coagulação, ausência de somitos, não desprendimento da cauda e ausência de batimento cardíaco. No final do período de exposição, a toxicidade aguda e a DL50 serão determinadas com base em um resultado positivo em qualquer uma das quatro observações registradas.

Esta proposta dispõe de resultados dos testes preliminares de alguns dos metalofármacos sinterizados ( Cu- L6; Cu-L10; Cu- L13 E Cu- L6/ Acetato), bastante animadores, no fungo alvo (Sporothrix brasiliensis) e em outros fungos ( Candida albicans, Candida não- albicans, Microsporum gypseum)
Dos compostos testados, Cu-L3 apresentou atividade fungistática e fungicida contra M. gypseum e também frente à C. albicans, embora nem todas as espécies não-albicans tenham sido sensíveis nas concentrações testadas (>1000 µg/ml).
Por outro lado, Cu-L6 e C4-L6/Acetato não foram antifúngicos nas concentrações testadas, pois a maioria das cepas testadas não foram inibidas ou mortas. Já, Cu-L10 e Cu-L13 se destacaram como antifúngicos. Para o composto Cu-L10, todas as cepas Candida spp. e M. gypseum foram sensíveis em valores de CIM de 31.3 a 500 µg/ml, enquanto maiores valores foram necessários para conferir ação fungicida (CFM de 31.3 a >1000 µg/ml). No entanto, nenhuma cepa de S. brasiliensis foi sensível ao Cu-L10. Já, o Cu-L13 se destacou por agir contra todos os gêneros fúngicos testados, com boa ação fungistática (CIM de 62.3 a 1000 µg/ml), embora maiores valores tenham sido necessários para conferir ação fungicida (CFM de 125 a 1000 µg/ml).




Uma vez vigente a proposta, espera-se que as questões ainda não elucidadas e que dificultam a prospecção de metalofármacos sejam esclarecidas, especialmente no que tange à atividade antifúngica contra S. brasiliensis resistente ao itraconazol e sua respectiva análise toxicológica. Assim, espera-se detectar o mínimo de duas moléculas ativas com potente atividade fungistática e fungicida (CIM e CFM ≤100 µg/ml). Pretende-se, também, elucidar o mecanismo de ação de tais moléculas selecionadas contra S. brasiliensis. Logo, se o mecanismo de ação ocorrer a nível de parede celular, pretende-se encontrar valores de CIM das microplacas contendo sorbitol maiores que os CIM daqueles isentas desse protetor osmótico, o qual protege a parede celular fúngica da penetração do composto-ativos. Se o mecanismo de ação ocorrer a nível de complexação com o ergosterol da membrana celular fúngica, espera-se encontrar valores de CIM elevados, uma vez que esses compostos se ligarão primeiramente ao ergosterol exógeno, formando um complexo, e, dessa forma, evitarão a formação de um complexo com o ergosterol próprio da membrana celular fúngica, resultando em um aumento no valor das CIM para esses compostos químicos. Por fim, espera-se que tais moléculas apresentem baixo ou nenhum grau de toxicidade em larvas de zebrafish. Dessa forma, a presente proposta pretende preencher as lacunas ainda incompreendidas no que tange ao mecanismo de ação e a segurança farmacológica dos metalofármacos com atividade contra isolados clínicos de S. brasiliensis, a fim de detectar as moléculas em potencial para a elaboração de um fármaco antifúngico no tratamento da esporotricose humana e animal.