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Na última década, mais estudos foram realizados sobre o impacto da privação do sono na saúde e bem-estar das pessoas. A prática de diminuir o sono, seja em privação total ou com a redução dele, tornou-se mais comum e está se tornando um problema global (CHATTU et al., 2018). O sono é um período com redução de estímulos, é essencial para o desenvolvimento do cérebro e suas funções (ORZEŁ-GRYGLEWSKA, 2010). É nesse momento que ele realiza diversas funções neuronais importantes como neurogênese, neuroplasticidade, regulação das emoções, humor e cognição (RINGLI et al., 2011; TONONI et al., 2014). O sono pode ser dividido em duas etapas: o sono REM (movimento rápido dos olhos) e o sono não REM. É durante o sono REM que é realizada a maioria desses processos, e é quando acontece o relaxamento do tônus muscular (DANG-VU et al., 2010). Com a diminuição do sono REM, onde acontece o controle emocional e processamento de emoções negativas, indivíduos são mais propensos a desenvolverem transtornos de ansiedade e depressão (BABSON et al., 2010; PIRES et al., 2016). Estudos desenvolvidos por RAMSAWH et al. (2009) mostraram que pacientes com ansiedade e privação do sono tinham piores sintomas ansiosos do que os pacientes com somente ansiedade e sono regulado.
Outra parte sujeita a ser comprometida em episódios de privação do sono é a cognição. É durante o sono que acontecem processos vitais para a formação de novas memórias, como a consolidação (KLINZING et al., 2019). A falta de sono também implica na redução da síntese proteica de diversas proteínas dos neurônios, resultando em menor neurogênese e plasticidade sináptica, resultando em declínio cognitivo (KOSTIN et al., 2021).
Tanto a ansiedade quanto o declínio cognitivo são duas consequências graves da privação do sono, e encontrar um tratamento a qual haja nessas vias é imperativo. O eixo microbiota-intestino-cérebro está cada vez mais sendo estudado e pesquisado nos últimos anos como uma forma de tratar transtornos e doenças psiquiátricas (ANSARI et al., 2020; DEN et al., 2020; MÖRKL et al., 2020). A microbiota intestinal é formada por bactérias, fungos e vírus que são benefícios ao intestino e realizam a proteção, homeostase corporal e a liberação de diversos metabólitos que modulam positivamente o organismo e o cérebro (KATAOKA, 2016; VICENTINI et al., 2021). Através da microbiota, portanto, é possível modular o cérebro graças a comunicação bidirecional entre esses dois órgãos mediada através do nervo vago e pela a circulação sistêmica (QUIGLEY, 2017). Uma maneira de modular a microbiota intestinal é através dos probióticos – microrganismos que quando ingeridos em quantidades adequadas não causa nenhum mal ao hospedeiro e tem efeito benéfico no corpo (DHALIWAL et al., 2018b).
A Komagataella pastoris KM71H é uma levedura metilotrófica que teve suas capacidades probióticas caracterizadas em 2015 por FRANÇA et al. (2015). Com o avanço dos estudos pelo eixo microbiota intestino cérebro, a qual utiliza a microbiota intestinal e a comunicação bidirecional entre o intestino e cérebro para modulação, foi hipotetizado os efeitos psicobióticos da K. pastoris KM71H em modelo animal. Em modelo de depressão, a K. pastoris KM71H foi capaz de modular o sistema imune, diminuir o estresse oxidativo de camundongos, e prevenir o comportamento tipo-depressivo em modelo por indução de lipopolissacarídeo bacteriano e estresse crônico de restrição por 1 hora (BIRMANN et al., 2021). Em estudos submetidos a revista, a K. pastoris foi capaz de modular o intestino e prevenir a disbiose intestinal em modelo de indução por uso de antibióticos (clindamicina), prevenindo contra o comportamento tipo depressivo, mantendo a integridade da barreira intestinal, reduzindo citocinas pró-inflamatórias, e aumentando a concentração do gênero Bacteroidetes e Lactobacillus. Em estudos a serem publicados, a K. pastoris realizou a reversão do comportamento tipo depressivo de camundongos em modelo de separação materna, mostrando a eficácia deste probiótico em reverter o comportamento tipo depressivo na fase adulta causado por eventos traumáticos na infância. Esse protocolo também mostrou as propriedades da K. pastoris em reduzir o comportamento tipo depressivo das mães, revertendo a depressão pós-parto. Este estudo mostrou que os mecanismos de ação podem estar envolvidos na redução do nível de corticosterona,
aumento da atividade de enzimas antioxidantes, redução do pH fecal (indicativo indireto de ácidos graxos de cadeia curta), e aumento do conteúdo de água das fezes, reduzindo a constipação.
Com resultados animadores envolvendo a K. pastoris KM71H, mais propriedades e mecanismos de ação desta levedura precisam ser explorados. Com isso em consideração, não se sabe muito sobre os efeitos da K. pastoris KM71H em reverter o comportamento tipo ansioso dos camundongos e o déficit cognitivo. Desta maneira, o modelo de privação do sono se torna um protocolo interessante pois é possível estudar estes dois mecanismos de ações

Para este estudo será utilizado camundongo Swiss machos de 25-35g. Para avaliar a capacidade do probiótico em prevenir o comportamento ansioso e déficit cognitivo, os camundongos serão divididos em quatro grupos: G1 – controle (PBS/sono); G2 – tratado (K. pastoris/sono); G3- induzido (PSB/privação); G4 induzido tratado (K. pastoris/privação). Os animais serão administrados com o probiótico/PBS durante 14 dias consecutivos na concentração de 1x108 unidades formadoras de colônia. A privação do sono acontecerá do dia 7 ao dia 10, e os camundongos terão até o dia 15 de recuperação. Os animais serão checados duas vezes por dia, uma de manhã e uma de tarde para garantir o bem-estar animal (será visto a temperatura para checar sinais de hipotermia; dermatite e qualidade de pelo para estresse; perda de peso para garantir que estão se alimentando; comportamento agressivo dentro da gaiola com ou outros camundongos, observando sinais de machucados). A gaiola dos camundongos que estão na privação do sono serão limpas todos os dias de manhã. No dia 13 e 14 os animais serão apresentados o biscoito para o teste do biscoito escondido, e no dia 14 a ração será reduzida em 30% para fazer o teste. No décimo quinto dia será realizado o teste comportamental do campo aberto, para avaliar a atividade locomotora dos camundongos, o teste da cruz elevada, para avaliar o comportamento ansioso, o teste Marble, para avaliar o comportamento ansioso/psicótico, o labirinto em y, para avaliar a memória e déficit
cognitivo, e o teste do biscoito escondido, para avaliar a memória olfativa dos camundongos. Após os testes comportamentais, os camundongos serão eutanasiados e confirmado a morte por deslocamento cervical. Será coletado o intestino, hipocampo, córtex pré-frontal e sangue dos camundongos. Para análises bioquímicas, será realizado ROS, TBARS, ON, carbonila, MAO, níveis de corticosterona e Bradford. Também será avaliado a quantificação das proteínas em PCR: GADPH, ERK1, NRF2, iNOS, IL-17, BDNF, IL-6. E também será realizado o Western Blot: GAPDH, receptor de glicocorticoide, BDNF, AKT, pAKT, Creb, pCreb, Sinaptofisina e PSD95.
Os resultados serão analisados através do software GraphPad Prism por análise de variância bidirecional seguida pelo teste de post hoc Tukey e sendo os valores de p definido em * p < 0,05; ** p < 0,01 *** p < 0,001 quando comparados ao controle e # p < 0,05; ## p < 0,01 e ### p < 0,001 quando comparado com o grupo induzido (privação do sono).
Os animais serão separados da seguinte forma:
Grupo ansiedade: Open field + cruz elevada + marble ROS, TBARS, Corticosterona, Bradford – Para que não seja feito vários ensaios comportamentais, será separado em ensaios da ansiedade e de déficit cognitivo. E nesta parte será realizado ROS, TBARS e Bradford com hipocampo, córtex pré-frontal e hipocampo, e corticosterona com o sangue.
Grupo déficit: open field + labirinto em y + biscoito escondido, Carbonila – Neste grupo será realizado os ensaios relacionados a cognição. O ensaio da carbonila necessita de uma homogeneização diferenciada, não utilizando o sobrenadante, precisando, portanto, de uma eutanásia específica para os tecidos do hipocampo, córtex pré-frontal.
Grupo NaK+ATPase – Neste ensaio é utilizado 50 microlitros de tecido, o que faria faltar dos outros ensaios como ROS e TBARS, sendo necessário um grupo só para ele para amostras hipocampo, córtex pré-frontal e intestino.
Grupo MAO – Para avaliar a MAO, é necessário utilizar múltiplas centrifugações após a coleta, sendo necessário um grupo só para este estudo para avaliar hipocampo, córtex pré-frontal e intestino.
Grupo Óxido nítrico – O ensaio do óxido nítrico utiliza tampão TFK, sendo necessário um grupo específico para homogeneizar hipocampo, córtex pré-frontal e intestino.
Grupo PCR: GADPH, ERK1, IL-6, NRF2, iNOS, IL-17, BDNF – Para medir as proteínas em PCR é realizado um protocolo de homogeneização específico das amostras do hipocampo, córtex pré-frontal e intestino.
Grupo WB: GAPDH, receptor de glicocorticoide, BDNF, AKT, pAKT, Creb, pCreb, Sinaptofisina e PSD95 - Para medir as proteínas em WB é realizado um protocolo de homogeneização específico das amostras do hipocampo, córtex pré-frontal e intestino.

Com a realização deste projeto, espera-se que a K. pastoris KM71H possa reverter o déficit cognitivo e comportamento ansioso de camundongos causado pela privação de sono de três dias. Além disto, espera-se identificar quais os mecanismos envolvidos no estabelecimento do déficit cognitivo e comportamento ansioso causado pela privação de sono e que a K. pastoris KM71H possa reverter as alterações ocasionadas.