Nome do Projeto
Efeitos do tratamento com um probiótico do gênero Lactobacillus enriquecido com selênio em comportamentos do tipo depressivo e ansioso em camundongos através do eixo microbiota intestino-cérebro
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/06/2024 - 15/12/2026
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O Transtorno depressivo maior (TDM) representa a condição clássica do grupo dos transtornos
depressivos, onde têm-se habituamente, sintomas como humor deprimido, perda de interesse ou
prazer, alterações no sono e no peso corporal. O TDM é uma das principais causas de
incapacidade em todo o mundo, e se apresenta com episódios depressivos recorrentes. A depressão é causada por influência mútua de múltiplos fatores psicológicos e sociais, bem
como fatores epigenéticos e, estudos sobre a progressão da depressão têm relatado anormalidades
nos circuitos cerebrais e alterações celulares e moleculares no cérebro depressivo, como alterações
na estrutura e morfologia funcional do córtex pré-frontal e do hipocampo, entre outras regiões
cerebrais. Apesar da fisiopatologia indefinida, estudos acumulados têm
mostrado uma forte associação entre os padrões da microbiota intestinal e distúrbios
neuropsiquiátricos, como depressão e ansiedade. O efeito da microbiota intestinal na função
cerebral é conhecido como eixo microbiota-intestino-cérebro, uma rede de comunicação
bidirecional, que inclui a microbiota intestinal, os metabólitos microbianos, o sistema imunológico,
o nervo vago, o sistema nervoso entérico e o sistema neuroendócrino. Sabe-se que os
sinais do cérebro modificam as modalidades de motilidade, sensorial e secretora do trato
gastrointestinal e, por sua vez, os sinais do intestino podem afetar o comportamento emocional e
os sistemas de modulação do estresse e da dor. Sabendo-se das limitações dos
tratamentos já existentes, a farmacologia e a psicoterapia, para TDM e transtornos de ansiedade e,
os efeitos adversos como: náuseas, diarreia, insônia, comprometimento cognitivo, disfunção sexual
e distúrbios do sono, muitas vezes levando à descontinuação do tratamento e a maior
recorrência de suicídio em indivíduos que apresentam esses quadros associados,
faz-se necessário a busca de novos tratamentos. À vista disso, tem sido dada considerável atenção
às propriedades benéficas dos probióticos, especialmente às diferentes espécies do
gênero Lactobacillus que demonstraram exercer atividades imunomoduladoras, anti-inflamatórias
e anticarcinogênicas. E, também, a probióticos enriquecidos com selênio (Se),
por ser um importante oligoelemento no corpo humano que possui efeitos antioxidantes e antiinflamatórios e tem uma importante influência na imunidade humana. Portanto, o
objetivo desse estudo é avaliar do composto probiótico Lactobacillus rhamnosus enriquecido com selênio
nos comportamentos do tipo depressivo e ansioso em camundongos através modulação da
microbiota intestinal. A metodologia utilizada será o tratamento com o probiótico por 14 dias, 1 vez
ao dia na dose de 8 x 108 UFC de Lactobacillus rhamnosus enriquecido com selênio. Para avaliar o efeito
do composto serão realizadas avaliações in vivo e ex vivo. In vivo, os testes comportamentais: teste
do labirinto em cruz elevado (TLCE) para avaliar o comportamento do tipo ansioso, o teste campo
aberto (TCA) será utilizado para avaliar a capacidade exploratória e o comportamento do tipo
ansioso, o teste de suspensão pela cauda (TSC) será realizado para avaliar o comportamento do tipo
depressivo através da imobilidade do animal frente a situação de desespero inescapável, o teste de
borrifagem de sacarose (TBS) usada para observar o quanto o animal terá um cuidado ao se limpar
e avaliará o comportamento relacionado à anedonia, e, o teste do nado forçado (TNF) também será
realizado para estimar o comportamento do tipo depressivo pela imobilidade do animal. Posterior
aos testes, os animais serão anestesiados com isoflurano, será feita punção cardíaca, deslocamento
cervical e retirados cérebro e intestinos para análises posteriores.
Objetivo Geral
Avaliar o efeito do probiótico Lactobacillus rhamnosus enriquecido com selênio nos
comportamentos do tipo depressivo e ansioso em camundongos.
comportamentos do tipo depressivo e ansioso em camundongos.
Justificativa
Em 2022 a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou a sua maior revisão sobre saúde mental,
mostrando que em 2019 cerca de 970 milhões de pessoas tinham alguma desordem mental, dentre
essas 28,9% com transtornos depressivos e 31% transtornos de ansiedade. Sendo que no ano de
2020, com a pandemia de COVID-19, esses números tiveram um grande aumento em apenas um
ano, 28% a mais de casos de Depressão e 26% a mais de casos de Transtorno de ansiedade (World
mental health report: transforming mental health mental, 2022). A inflamação exacerbada que
frequentemente acompanha o estresse e a depressão desencadeia proliferação de bactérias
patogênicas que incentivam a disbiose e um intestino permeável (Madison and Glaser, 2019).
Apesar das taxas de incidência crescentes o efeito do tratamento para ansiedade e depressão é
insatisfatório. O tratamento convencional de primeira linha, incluindo psicoterapia e medicação,
atinge apenas 50% de taxa de remissão (Guo et al, 2023). Nos últimos anos, o tratamento com
probióticos para transtornos neuropsiquiátricos tem sido amplamente estudado, por conta da
relação bem estabelecida entre o intestino e o cérebro (Otaka et. al, 2021; Yang et. al, 2022; Birmann
et. al, 2023). Os probióticos possuem algumas vantagens como produção em larga escala,
sustentável e segura, com baixo custo, alta eficiência, fontes disponíveis de matérias-primas e
produção sem limitação por estação (Xu et. al, 2018). Yang et. al, mostraram em seu estudo que o
tratamento com Lactobacillus casei em ratos com indução de depressão pós-parto, melhorou os
sintomas do tipo depressivo e ansioso em testes comportamentais como TBS, TSC, TNF e TCLE, assim
como a paroxetina, não havendo diferença significativa entre esses dois grupos (Yang et. al, 2022).
Em outro estudo, com indução da disfunção da barreira intestinal por exposição a micotoxina
desoxinivalenol (DON), no qual os camundongos foram tratados com Lactobacillus casei ATCC 393
enriquecido com selênio, o tratamento inibiu significativamente a redução da altura das vilosidades
intestinais e o aumento da profundidade das criptas induzido pela DON, além de regular
significativamente a composição e a função da microbiota intestinal e aliviar a disbiose causada pela
indução (Xiaofan et. al, 2022). Ainda, em outro estudo que avaliou o efeito do probiótico
Lactobacillus acidophilus enriquecido com selênio num quadro de colite crônica, o tratamento
diminuiu as concentrações de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12p70, TNF-α e IL-23 no grupo induzido + L.
acidophilus enriquecido com Se, em comparação com o grupo induzido (Wu et. al, 2021). E
recentemente, um estudo mostrou o resultado positivo do tratamento com Komagataella pastoris
KM71H, uma levedura probiótica, na modulação da expressão de ocludina, Zo-1 e Zo-2 no intestino
delgado de camundongos com disbiose induzida por antibióticos, melhorando assim a integridade
da barreira intestinal (Birmann et. al, 2023). Sabendo-se que os fármacos disponíveis para a
depressão não apresentam o efeito desejado, demoram para apresentar o efeito, muitos pacientes
não apresentam resposta, e induzem inúmeros efeitos adversos, que o eixo que liga o Sistema
Nervoso Central e o Intestino tem comunicação bidirecional, desejamos avaliar se o tratamento com
o probiótico Lactobacillus rhamnosus enriquecido com selênio irá melhorar a saúde da microbiota
intestinal e prevenir sintomas do tipo depressivo e ansioso.
mostrando que em 2019 cerca de 970 milhões de pessoas tinham alguma desordem mental, dentre
essas 28,9% com transtornos depressivos e 31% transtornos de ansiedade. Sendo que no ano de
2020, com a pandemia de COVID-19, esses números tiveram um grande aumento em apenas um
ano, 28% a mais de casos de Depressão e 26% a mais de casos de Transtorno de ansiedade (World
mental health report: transforming mental health mental, 2022). A inflamação exacerbada que
frequentemente acompanha o estresse e a depressão desencadeia proliferação de bactérias
patogênicas que incentivam a disbiose e um intestino permeável (Madison and Glaser, 2019).
Apesar das taxas de incidência crescentes o efeito do tratamento para ansiedade e depressão é
insatisfatório. O tratamento convencional de primeira linha, incluindo psicoterapia e medicação,
atinge apenas 50% de taxa de remissão (Guo et al, 2023). Nos últimos anos, o tratamento com
probióticos para transtornos neuropsiquiátricos tem sido amplamente estudado, por conta da
relação bem estabelecida entre o intestino e o cérebro (Otaka et. al, 2021; Yang et. al, 2022; Birmann
et. al, 2023). Os probióticos possuem algumas vantagens como produção em larga escala,
sustentável e segura, com baixo custo, alta eficiência, fontes disponíveis de matérias-primas e
produção sem limitação por estação (Xu et. al, 2018). Yang et. al, mostraram em seu estudo que o
tratamento com Lactobacillus casei em ratos com indução de depressão pós-parto, melhorou os
sintomas do tipo depressivo e ansioso em testes comportamentais como TBS, TSC, TNF e TCLE, assim
como a paroxetina, não havendo diferença significativa entre esses dois grupos (Yang et. al, 2022).
Em outro estudo, com indução da disfunção da barreira intestinal por exposição a micotoxina
desoxinivalenol (DON), no qual os camundongos foram tratados com Lactobacillus casei ATCC 393
enriquecido com selênio, o tratamento inibiu significativamente a redução da altura das vilosidades
intestinais e o aumento da profundidade das criptas induzido pela DON, além de regular
significativamente a composição e a função da microbiota intestinal e aliviar a disbiose causada pela
indução (Xiaofan et. al, 2022). Ainda, em outro estudo que avaliou o efeito do probiótico
Lactobacillus acidophilus enriquecido com selênio num quadro de colite crônica, o tratamento
diminuiu as concentrações de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12p70, TNF-α e IL-23 no grupo induzido + L.
acidophilus enriquecido com Se, em comparação com o grupo induzido (Wu et. al, 2021). E
recentemente, um estudo mostrou o resultado positivo do tratamento com Komagataella pastoris
KM71H, uma levedura probiótica, na modulação da expressão de ocludina, Zo-1 e Zo-2 no intestino
delgado de camundongos com disbiose induzida por antibióticos, melhorando assim a integridade
da barreira intestinal (Birmann et. al, 2023). Sabendo-se que os fármacos disponíveis para a
depressão não apresentam o efeito desejado, demoram para apresentar o efeito, muitos pacientes
não apresentam resposta, e induzem inúmeros efeitos adversos, que o eixo que liga o Sistema
Nervoso Central e o Intestino tem comunicação bidirecional, desejamos avaliar se o tratamento com
o probiótico Lactobacillus rhamnosus enriquecido com selênio irá melhorar a saúde da microbiota
intestinal e prevenir sintomas do tipo depressivo e ansioso.
Metodologia
Os camundongos Swiss serão aclimatados por 7 dias, e serão divididos em 5 grupos em cada
set: Grupo Veículo, Grupo Lactobacillus rhamnosus ( 8 x 108 UFC/dia) + selênio, Grupo Lactobacillus
rhamnosus ( 8 x 108 UFC/dia), Grupo Selênio e Grupo Fluoxetina (2 mg/kg/dia). Passarão então por
um tratamento via oral de 14 dias e, no 15º dia serão expostos a testes comportamentais, e
eutanasiados no dia seguinte.
No 1º set serão realizados:
Teste de suspensão pela cauda e Teste de Borrifagem de Sacarose.
Análise das Espécies Reativas, da Peroxidação lipídica e do Nitrato e nitrito das amostras cerebrais
e intestino, também a análise da microbiota intestinal e dos níveis de corticosterona plasmática.
No 2º set serão realizados:
Teste do labirinto em cruz elevado, Teste do campo aberto e Teste do nado forçado.
Avaliação da Peroxidação lipídica, a detecção do teor de selênio nos tecidos, a Histologia do
cérebro e intestino, quantificar os níveis de Ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e os níveis de
corticosterona plasmática.
As cepas bacterianas probióticas serão biossintetizadas pelo Laboratório de Microbiologia do
Curso de Biotecnologia da UFPel. O tempo de 14 dias foi escolhido baseado em testes
anteriores com probióticos (Birmann et. al, 2023). A dose de selênio do grupo selênio (grupo 4)
será escolhida após o enriquecimento do Lactobacillus rhamnosus com selênio e determinação do
teor de selênio que foi incorporado nas bactérias.
Após os tratamentos, os animais serão submetidos aos testes comportamentais no dia 15 e no
dia 16 será feita eutanásia e retirada de tecidos para análises posteriores.
Testes comportamentais
Teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) modificado
O TLCE será utilizado para avaliar o comportamento do tipo ansioso. O aparato utilizado é um
labirinto de madeira em formato de cruz, contendo dois braços abertos (30cm x 5cm), dois braços
fechados (30cm x 5cm x 15cm) e o centro (5cm x 5cm) (File and Pellow, 1985). Os parâmetros
avaliados são o número de entradas nos braços abertos e o tempo de permanência nos mesmos.
Teste do campo aberto (TCA)
Será realizado a fim de descartar qualquer efeito de uma possível limitação locomotora ou
exploratória causada pelo tratamento com o composto (Walsh; Cummins, 1976). Os camundongos
serão colocados no centro de uma caixa de madeira (30 cm × 30 cm × 15 cm) divididos em nove
quadrados de áreas iguais, e durante 4 min, serão avaliadas o número de quadrados cruzados
(atividade locomotora) e o número de elevações (atividade exploratória).
Teste da suspensão da cauda (TSC)
O TSC com algumas modificações (Steru et al., 1985) será realizado para avaliar o
comportamento de desespero, sendo este um dos sintomas da depressão. Cada camundongo será
suspenso individualmente 50 cm acima do chão com fita adesiva colocada a aproximadamente 1 cm
da ponta da cauda. O tempo de imobilidade nesta condição será registrado durante os últimos 4
minutos de uma sessão de 6 minutos, no qual os dois primeiros minutos servirá apenas para
habituar o animal. A definição de imobilidade é a ausência de comportamento de fuga apresentado
pelo animal.
Teste da borrifagem de sacarose (TBS)
O teste da borrifagem de sacarose (TBS) permite avaliar o comportamento de autocuidado
como comportamento motivacional de acordo com protocolo usado em outros trabalhos (Birmann
et al., 2020; Liu et al., 2018). Este método permite pulverizar uma solução de sacarose a 10% na
camada dorsal de camundongos em sua gaiola. Devido a viscosidade desta solução, a sacarose suja
os pêlos dos camundongos e os animais iniciam o comportamento de autolimpeza. Será realizado
por 5 minutos, e durante este intervalo registrado o tempo de latência e o tempo total gasto na
limpeza.
Teste do nado forçado (TNF)
O teste do nado forçado permite avaliar o comportamento do tipo antidepressivo em animais
através da análise do tempo de imobilidade como a ausência de comportamento orientado à fuga.
Foi descrito originalmente por Porsolt et al. (1997) e será realizado com algumas modificações
(Sabedra et al., 2019). Os animais serão colocados individualmente em um cilindro (10 cm de
diâmetro por 25 cm de altura), contendo 19 cm de água a uma temperatura de 25 ± 1 °C. O tempo
total do teste é de 6 minutos, porém o tempo de imobilidade será registrado apenas nos últimos 4
minutos, pois os 2 primeiros minutos serão destinados a habituação do animal. Os animais serão
considerados imóveis quando permanecerem flutuando imóveis na água ou fizerem movimentos
para manter o focinho acima da superfície da água.
Após a realização dos testes de comportamento no dia 15 do estudo, os animais serão
sedados com isoflurano e será realizada punção cardíaca para coleta do tecido sanguíneo. A
eutanásia será realizada por deslocamento cervical, e então retirados cérebro, intestino delgado,
intestino grosso e amostras fecais, para as análises bioquímicas.
set: Grupo Veículo, Grupo Lactobacillus rhamnosus ( 8 x 108 UFC/dia) + selênio, Grupo Lactobacillus
rhamnosus ( 8 x 108 UFC/dia), Grupo Selênio e Grupo Fluoxetina (2 mg/kg/dia). Passarão então por
um tratamento via oral de 14 dias e, no 15º dia serão expostos a testes comportamentais, e
eutanasiados no dia seguinte.
No 1º set serão realizados:
Teste de suspensão pela cauda e Teste de Borrifagem de Sacarose.
Análise das Espécies Reativas, da Peroxidação lipídica e do Nitrato e nitrito das amostras cerebrais
e intestino, também a análise da microbiota intestinal e dos níveis de corticosterona plasmática.
No 2º set serão realizados:
Teste do labirinto em cruz elevado, Teste do campo aberto e Teste do nado forçado.
Avaliação da Peroxidação lipídica, a detecção do teor de selênio nos tecidos, a Histologia do
cérebro e intestino, quantificar os níveis de Ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e os níveis de
corticosterona plasmática.
As cepas bacterianas probióticas serão biossintetizadas pelo Laboratório de Microbiologia do
Curso de Biotecnologia da UFPel. O tempo de 14 dias foi escolhido baseado em testes
anteriores com probióticos (Birmann et. al, 2023). A dose de selênio do grupo selênio (grupo 4)
será escolhida após o enriquecimento do Lactobacillus rhamnosus com selênio e determinação do
teor de selênio que foi incorporado nas bactérias.
Após os tratamentos, os animais serão submetidos aos testes comportamentais no dia 15 e no
dia 16 será feita eutanásia e retirada de tecidos para análises posteriores.
Testes comportamentais
Teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) modificado
O TLCE será utilizado para avaliar o comportamento do tipo ansioso. O aparato utilizado é um
labirinto de madeira em formato de cruz, contendo dois braços abertos (30cm x 5cm), dois braços
fechados (30cm x 5cm x 15cm) e o centro (5cm x 5cm) (File and Pellow, 1985). Os parâmetros
avaliados são o número de entradas nos braços abertos e o tempo de permanência nos mesmos.
Teste do campo aberto (TCA)
Será realizado a fim de descartar qualquer efeito de uma possível limitação locomotora ou
exploratória causada pelo tratamento com o composto (Walsh; Cummins, 1976). Os camundongos
serão colocados no centro de uma caixa de madeira (30 cm × 30 cm × 15 cm) divididos em nove
quadrados de áreas iguais, e durante 4 min, serão avaliadas o número de quadrados cruzados
(atividade locomotora) e o número de elevações (atividade exploratória).
Teste da suspensão da cauda (TSC)
O TSC com algumas modificações (Steru et al., 1985) será realizado para avaliar o
comportamento de desespero, sendo este um dos sintomas da depressão. Cada camundongo será
suspenso individualmente 50 cm acima do chão com fita adesiva colocada a aproximadamente 1 cm
da ponta da cauda. O tempo de imobilidade nesta condição será registrado durante os últimos 4
minutos de uma sessão de 6 minutos, no qual os dois primeiros minutos servirá apenas para
habituar o animal. A definição de imobilidade é a ausência de comportamento de fuga apresentado
pelo animal.
Teste da borrifagem de sacarose (TBS)
O teste da borrifagem de sacarose (TBS) permite avaliar o comportamento de autocuidado
como comportamento motivacional de acordo com protocolo usado em outros trabalhos (Birmann
et al., 2020; Liu et al., 2018). Este método permite pulverizar uma solução de sacarose a 10% na
camada dorsal de camundongos em sua gaiola. Devido a viscosidade desta solução, a sacarose suja
os pêlos dos camundongos e os animais iniciam o comportamento de autolimpeza. Será realizado
por 5 minutos, e durante este intervalo registrado o tempo de latência e o tempo total gasto na
limpeza.
Teste do nado forçado (TNF)
O teste do nado forçado permite avaliar o comportamento do tipo antidepressivo em animais
através da análise do tempo de imobilidade como a ausência de comportamento orientado à fuga.
Foi descrito originalmente por Porsolt et al. (1997) e será realizado com algumas modificações
(Sabedra et al., 2019). Os animais serão colocados individualmente em um cilindro (10 cm de
diâmetro por 25 cm de altura), contendo 19 cm de água a uma temperatura de 25 ± 1 °C. O tempo
total do teste é de 6 minutos, porém o tempo de imobilidade será registrado apenas nos últimos 4
minutos, pois os 2 primeiros minutos serão destinados a habituação do animal. Os animais serão
considerados imóveis quando permanecerem flutuando imóveis na água ou fizerem movimentos
para manter o focinho acima da superfície da água.
Após a realização dos testes de comportamento no dia 15 do estudo, os animais serão
sedados com isoflurano e será realizada punção cardíaca para coleta do tecido sanguíneo. A
eutanásia será realizada por deslocamento cervical, e então retirados cérebro, intestino delgado,
intestino grosso e amostras fecais, para as análises bioquímicas.
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se com este projeto encontrar um novo probiótico com efeito do tipo antidepressivo, a fim de desenvolver novas alternativas terapêuticas para a depressão. Além, disso, este projeto contribuirá na formação de alunos de doutorado, mestrado e iniciação científica.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| ALINE SILVEIRA GONÇALVES | |||
| CESAR AUGUSTO BRUNING | 2 | ||
| CRISTIANI FOLHARINI BORTOLATTO | 2 | ||
| FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE | 1 | ||
| LUCIELLI SAVEGNAGO | 1 | ||
| MARCELO HEINEMANN PRESA | |||
| MARCIA JUCIELE DA ROCHA | |||
| MARIANA PARRON PAIM | |||
| PALOMA TABORDA BIRMANN |