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A segurança alimentar global enfrenta ameaças decorrentes de perdas nas colheitas ocasionadas principalmente por plantas daninhas, patógenos e insetos. As plantas daninhas emergem como uma das ameaças agrícolas mais onerosas, acarretando perdas de produtividade que excedem 45% em variedades de culturas de campo, já as perdas provenientes de insetos (20%) e doenças (25%) são menos expressivas, porém ainda assim são consideráveis (GNANAVEL, 2015).
Desde meados do século passado, os herbicidas sintéticos ganharam importância crescente no controle de plantas daninhas. Com a introdução de culturas resistentes ao glifosato em 1995 (Roundup Ready®), observou-se uma redução no número de empresas dedicadas à pesquisa e descoberta de novas moléculas herbicidas. Esse cenário contribuiu para a ausência de lançamentos de novos mecanismos de ação ao longo dos últimos 25 anos (DUQUE, 2012; DAYAN, 2019).
Consequentemente o uso ao longo de vários anos, resultou em plantas daninhas resistentes a herbicidas anteriormente eficazes, demandando a identificação de compostos com novos mecanismos de ação, a fim de suplementar ou até mesmo substituir os compostos que perderam eficácia no controle. Do mesmo modo, o controle de doenças, depende do uso de fungicidas sintéticos, porém, a utilização desses produtos gera preocupação devido aos efeitos indutores de resistência em fungos patogênicos e o impacto ambiental que pode ser gerado (OLIVEIRA et al., 2017).
A exploração de estratégias que compreendem produtos biológicos e novas moléculas tornou-se essencial para o manejo sustentável de plantas daninhas e patógenos. A variabilidade estrutural das fitotoxinas presentes na natureza, oferece uma fonte rica de compostos que podem ser utilizadas no desenvolvimento de produtos naturais como novos mecanismos de ação (DAYAN e DUKE, 2014).
Entre os 20 principais mecanismos de ação herbicida, os inibidores da enzima glutamina sintetase (GS) e da hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD), cujos herbicidas têm como base o princípio ativo glufosinato de amônio e mesotrione, respectivamente, foram originados de substâncias naturais (LEASON et al., 1982; LEE et al., 1997). Assim como as estrobilurinas, que foram inspiradas em um grupo de produtos naturais produzidos por cogumelo paleárticos (Strobilurus tenacellus (Pers. ex Fr.) Sing.; e, Oudemansiella mucida (Schrad.) Höhn.) e possibilitou o desenvolvimento de produtos como azoxistrobina, trifloxistrobina e fluoxastrobina (DUKE et al, 2010).
Entretanto, investigações de biologia molecular e exploração de compostos naturais sugerem que ainda existem diversos compostos potencialmente desconhecidos a serem explorados. Os extratos vegetais são exemplos de produtos naturais que possuem muitas substâncias ativas comprovadamente eficazes que podem ser isoladas e utilizadas como pesticidas ou podem servir como protótipo para síntese química no desenvolvimento de novas classes de pesticidas (CARDOSO et al., 2022).
Um desafio no uso de extrato vegetais é o desenvolvimento de formulações capazes de manter os ingredientes ativos por mais tempo, considerando que, como os extratos vegetais possuem moléculas orgânicas que tendem a serem mais sensíveis à degradação, transformadas em moléculas mais simples, perdendo sua atividade e seu potencial de uso. A adoção de compostos naturais, como pesticidas surge como uma alternativa atrativa para diminuir a dependência da agricultura em relação aos pesticidas sintéticos (CAMPOS et al., 2023).
A Heteranthera reniformis destaca-se como potencial fonte de compostos bioativos. Esta planta, é planta daninha infestante das plantações de arroz irrigado, é notável pelo seu rápido crescimento em ambientes aquáticos com alta luminosidade e temperaturas elevadas. Como resultado, ela possui o potencial de ocupar rapidamente espaços disponíveis. A notável capacidade invasiva dessa espécie pode estar associada à sua habilidade de produzir metabólitos especializados, incluindo compostos com atividade herbicida (SHARMA et al., 2016).
Alguns autores relataram o potencial das substâncias exsudadas pelas raízes de Heteranthera reniformis na redução das variáveis de crescimento comprimento de raiz e parte aérea de alface (Lactuca sativa), capim-arroz (Echinochloa sp.) e sagitária (Sagittaria montevidensis) (PERBONI et al., 2020). Destas, o capim-arroz e a sagitária são plantas daninhas que causam perdas na produtividade na cultura do arroz (REZAEIEH et al., 2015), assim como o angiquinho (Aeschynomene indica) destaca-se uma planta problemática (HARTMANN et al., 2019).
Outros autores relataram o efeito dessas mesmas substâncias obtidas a partir de Heteranthera reniformis reduzindo a esporulação de Bipolaris oryzae (QUEVEDO et al., 2020). Assim como Bipolaris oryzae, outros fungos de grande importância para a cultura do arroz, assim como mancha parda (Bipolaris oryzae), brusone (Pyricularia oryzae (sin. Magnaporthe oryzae)), mancha marrom (Bipolaris sorokiniana) (SOFIAN et al., 2019; CHANNAKESHAVA et al., 2018), têm potencial para serem estudados quanto a eficiência do controle pela aplicação dos extratos dessa planta.
A identificação dos compostos químicos presentes nas plantas é de extrema importância para o desenvolvimento de novos herbicidas e fungicidas naturais ecologicamente sustentáveis, destinados ao manejo eficaz e ambientalmente responsável das plantas daninhas e patógenos. Acredita-se que exista uma ampla faixa de 200.000 a 1.000.000.000 de metabólitos presentes no reino vegetal (FANG et al., 2019). Essa diversidade representa uma das limitações a considerar ao selecionar as tecnologias para detecção e quantificação dos metabólitos de interesse em um perfil metabólico específico.
Embora nenhum sistema analítico único possa cobrir todo o metaboloma, as estratégias atuais dependem de abordagens baseadas em espectrometria de massa ou ressonância magnética nuclear (RMN) (ALSEEKH e FERNIE, 2018). A avaliação do perfil de metabólitos pode ser conduzida por meio de cromatografia líquida (LC) e/ou cromatografia gasosa (GC) acopladas à espectrometria de massas (MS). A análise do perfil metabólico de plantas por LC-EM é uma abordagem utilizada para identificar o perfil de metabólitos especializados, como fenilpropanoides, terpenoides e alcaloides (HUANG et al., 2008; MATSUDA et al., 2010; MATSUDA et al., 2009).
A CG-EM tem cobertura relativamente ampla de classes de compostos e é adequada para a separação e análise de misturas contendo constituintes apolares, voláteis e termicamente estáveis, incluindo ácidos orgânicos e aminoácidos, açúcares, álcoois de açúcar, intermediários fosforilados e compostos lipofílicos (LISEC et al., 2006). Em contraste com as metodologias fundamentadas na MS que detectam a nível molecular, a abordagem da RMN opera a nível atômico, sendo especialmente valiosa em experimentos de monitoramento de isótopos e elucidando a estrutura molecular (FERNIE e TOHGE, 2017). Apesar das vantagens inerentes da RMN, as abordagens cromatográficas acopladas e baseadas em MS, como a GC-MS e LC-MS, são utilizadas com maior frequência.
Considerando que estudos fitoquímicos têm sido fundamentais para a descoberta de moléculas com aplicação na agricultura, e dado o grande número de compostos naturais que serviram como base para diversos agrotóxicos, há justificativa para explorar mais profundamente o potencial da espécie aguapé-mirim como fonte de compostos com atividade biológica.

1) Efeito herbicida de extratos de Heteranthera reniformis sobre a geminação de sementes

-Seleção do solvente mais ativo em atividade herbicida de extratos de Heteranthera reniformis
Os resíduos remanescentes após a evaporação dos solventes hexano, acetato de etila e metanol serão pesados e ressuspendidos em uma solução contendo Tween 80 (5%). A ressuspenção busca atingir a concentração de 6 mg mL-1 (6000 ppm). Os tratamentos consistirão em extratos das partes de H. reniformis (folhas, colmo, meristema e raiz) extraídos com os solventes hexano, acetato de etila e metanol e, controles: água destilada e Tween 80 (5%). O delineamento experimental será inteiramente casualizado com quatro repetições.
Nas placas de Petri serão adicionadas 25 sementes e posteriormente o extrato em volume correspondente a duas vezes o peso do papel Germitest. As placas de Petri serão seladas com Parafilm® e levadas à câmara de germinação do tipo BOD, com temperatura e fotoperíodo regulado de acordo as regras de análise de sementes (BRASIL, 2009).

- Avaliação da atividade herbicida do extrato mais ativo de Heteranthera reniformis
Depois que a fração mais ativa dos solventes for estabelecida (estudo I), serão realizados estudos de concentrações, onde serão testadas as concentrações de 0 mg mL-1 (0 ppm), 3 mg mL-1 (3000 ppm), 6 mg mL-1 (6000 ppm), 9 mg mL-1 (9000 pmm), 12 mg mL-1 (12000 ppm). Para obter essas concentrações será adotada a metodologia descrita no estudo I. Os tratamentos consistirão das concentrações do extrato mais ativo e, os controles serão: água destilada, Tween 80 (5%) e o herbicida imazapique+imazapir ou oxifluorfen. O delineamento experimental será inteiramente casualizado contendo quatro repetições.
As concentrações da fração mais ativa serão testadas sobre a germinação das sementes de alface (Lactuca sativa), capim-arroz (Echinochloa crusgalli) e angiquinho (Aeschynomene indica). A temperatura de condução será de 20º C a 25º C dependendo da espécie e o fotoperíodo será de 12 horas.

2) Efeito fungicida de extratos de Heteranthera reniformis em fungos de importância para rizicultura e triticultura

- Seleção do solvente mais ativo em atividade fungicida de extratos de Heteranthera reniformis
Para o estudo da caracterização dos sintomas causados pela aplicação dos extratos de H. reniformis sobre o desenvolvimento de patógenos, serão utilizados Biporalis oryzae, Pyricularia oryzae, Fusarium graminearum e Bipolaris sorokiniana.
Serão utilizados extrato das partes de H. reniformis (folhas, colmo, meristema e raiz). Os tratamentos consistirão em extratos hexano, acetato de etila e metanol na concentração de 0,4 mg mL-1 (400 ppm), e, os controles: BDA, BDA+DMSO e fungicida (Vitavax®) na concentração de 140 μL mL-1 de meio. O delineamento experimental será inteiramente casualizado contendo seis repetições.
As avaliações realizadas nas colônias dos patógenos isolados intermediários serão avaliadas conforme formato, elevação, margem e coloração baseando-se na escala microbiológica de Pelczar (1994) e carta de cores de solo de acordo com Munsell (1954).

- Avaliação da atividade fungicida do extrato mais ativo de Heteranthera reniformis
Após a determinação da fração mais ativa, serão realizados os estudos de concentrações, onde serão testadas concentrações de 0 mg mL-1 (0 ppm), 0,25 mg mL-1 (250 ppm), 0,5 mg mL-1 (500 ppm), 1 mg mL-1 (1000 pmm), 2 mg mL-1 (2000 ppm) do extrato ativo de H. reniformis sobre o crescimento de Biporalis oryzae, Pyricularia oryzae, Fusarium graminearum e Bipolaris Sorokiniana isolado intermediário agressividade classificados quanto a agressividade por MOREIRA-NUNEZ, (2017).
Serão realizados estudos de germinação de esporos em extrato ativo H. reniformis. Será realizada a contagem de esporos não germinados, 24 horas após tratamento, e será determinado a porcentagem de inibição da germinação.

3) Perfil metabólico de folhas, colmos, meristemas e raízes de Heteranthera reniformis

- Identificação dos compostos por GC-EM
As análises em CG-EM serão realizadas com os extratos hexano sem derivatização e hexano, acetato de etila e metanol derivatizados de folhas, colmos, meristemas e raízes de H. reniformis. As amostras não derivatizadas e derivatizadas serão analisadas em equipamento Shimadzu GCMS QP2010 Ultra, com auto injetor AOC-20i. Os parâmetros de injeção, cromatografia e espectrometria de massas seguirão método descrito por DATTA et al. (2012) (OU LISEC, 2006).
Os compostos identificados serão comparados a três bancos de dados: Golm Metabolome Database (GMD: http://gmd.mpimp-golm), MassBank Europa (https://massbank.eu/MassB) e Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST: https://webbook.nist.gov). Após a integração dos picos, os dados serão normalizados de acordo com o padrão interno de cada amostra antes de serem combinados e listados.

- Identificação de compostos por LC-EM
Para as análises em LC-EM, serão diluídos 3 mg de extrato das partes da planta (folha, colmo, meristema e raiz) dos extratos hexano, metanol e acetato de etila em 1000 μL de acetonitrila. A separação cromatográfica será realizada em cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência (UPLC). A análise de espectrometria de massa será realizada em um equipamento Thermo Q Exactive Focus (ThermoFisher) operado nos modos de ionização positivo e negativo.
Para a identificação de alguns compostos fenólicos, serão utilizados padrões comerciais. Além disso, os compostos serão caracterizados pelo espectro no UV/VIS (220-800 nm), tempo de retenção relativo ao padrão externo, espectro de massas e perfil de fragmentação (MSn).

4) Compostos isolados de Heteranthera reniformis com efeito fungicida e herbicida

- Cromatografia em camada delgada (CCD)
Os compostos provenientes do extrato bruto, das frações, subfrações e os compostos puros serão monitorados em placas de vidro contendo sílica gel na superfície (250 μm) com revelador fluorescente. Os compostos separados na placa serão visualizados em câmara de luz ultravioleta (UV) nos comprimentos de onda de 245 e 365 nm, em câmara contendo iodo, e, também por aplicação spray de anisaldeído.

- Bioensaio antifúngico (Bioensaio CF63)
A atividade antifúngica dos extratos brutos, das frações e subfrações provenientes do extrato mais ativo de H. reniformis será avaliada em ensaios de bioautografia utilizando placas de sílica, descritas na CCD, inoculadas com Colletotrichum spp. (WEDGE e NAGEL, 2000). As placas serão eluídas utilizando como fase móvel, geralmente, as misturas de hexano: acetato de etila ou acetato de etila: metanol.

- Purificação dos compostos
Os próximos passos serão guiados conforme as orientações estabelecidas por Perboni (2019). Os extratos obtidos terão seu perfil químico estudado a partir do uso das técnicas de cromatografia gasosa e/ou cromatografia líquida, ambas acopladas a espectrômetro de massas. Após a caracterização química, os extratos serão fracionados com o intuito de identificar os possíveis compostos bioativos.

- Síntese do composto
Os produtos sintéticos serão obtidos em laboratório no LASOL (Laboratório de síntese orgânica limpa) e/ou em empresas especializadas para a síntese de compostos sintéticos. As reações serão acompanhadas por cromatografia em fase gasosa, camada fina e por RMN de 1H e 13C. A purificação dos produtos será realizada por cromatografia em coluna, destilação e/ou recristalização. Após a obtenção dos produtos, os mesmos serão caracterizados por RMN de 1H e 13C, infravermelho, CG/EM e espectrometria de massas de alta resolução.

Preparar o material necessário para início da execução do projeto.
Realizar as análises referentes ao Capítulo I do projeto de tese.
Comprovar qual é o extrato mais ativo referente a sua atividade herbicida e assim caracterizar os sintomas fitotóxicos nas sementes.
Realizar as análises referentes ao Capítulo II do projeto de tese.
Comprovar qual é o extrato mais ativo referente a atividade fungicida e assim caracterizar os sintomas causados nos patógenos.
Isolar um composto de extrato de H. reniformis com atividade fungicida.
Encaminhar para o comporto isolado para síntese.
Comprovar a ação antifúngica e fitotóxica do composto sintetizado a partir do extrato de H. reniformis.