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Nesta perspectiva, neste projeto, pretendemos investigar os padrões de metilação do DNA em amostras cerebrais (hipocampo) e periféricas (leucócitos) de camundongos machos submetidos ao modelo de depressão do ECMI. Com isso será possível investigarmos que perfil de metilação do DNA que pode ser preditor de susceptibilidade ou resiliência ao desenvolvimento do TDM.
Diante disto, assumimos como hipótese que ao compararmos os parâmetros de metilação do DNA em hipocampo e leucócitos dos animais submetidos ao ECMI (suscetíveis ou resilientes ao estresse) com animais do grupo controle, evidenciaremos padrões característicos de metilação do DNA em determinados genes que estarão intimamente associados ao fenótipo de TDM no grupo com comportamento do tipo depressivo (susceptíveis ao estresse), enquanto um perfil diferente de ambos será observado no grupo resiliente. Diante do exposto, acreditamos que ao testarmos tais hipóteses teremos resultados pré-clínicos robustos poderão estimular investigações futuras utilizando ensaios clínicos, permitindo aprofundar na busca de biomarcadores periféricos de suscetibilidade ao estresse e de diagnóstico e tratamento para o TDM.

Animais
Em todos os experimentos serão utilizados 28 camundongos machos, C57BL/6 (Mus musculus), adultos (25g machos) provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), em um ciclo de doze horas de claro/escuro (luz a partir das 7:00 horas), temperatura de 22 ± 1°C, água e ração ad libitum e, mantidos em caixas plásticas contendo 3 - 4 animais por caixa. Todas as tarefas comportamentais serão conduzidas entre 13:00 e 17:00 horas e os animais serão ambientados por 24 horas antes na sala de realização do respectivo experimento comportamental. Nenhum procedimento experimental será realizado no espaço destinado a manutenção dos roedores, a fim de evitar a produção de qualquer tipo de estresse comportamental. Um dia após a realização de todos os testes comportamentais amostras sanguíneas e de tecido cerebral serão coletadas para posterior análise. Este projeto seguirá as normas adotadas pela nossa instituição as quais são baseadas nas diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), neste momento encontra-se submetido ao CEUA da Instituição para ser analisado conforme documento em Anexo.
Procedimento Experimental
Após habituação de 7 dias no biotério setorial, os animais serão analisados frente ao consumo de sacarose basal (Baseline), como será posteriormente descrito (seção 4.3.). Após a primeira etapa do protocolo, os animais serão aleatoriamente divididos em 2 grupos CT (controle, não desafiados; n=7) e ECMI (submetidos ao protocolo do Estresse Crônico Moderado Imprevisível; n=20) que terá duração de 6 semanas (descrição no ítem 4.4.) onde terão seus comportamentos avaliados individualmente. Após este período, os animais serão divididos em 3 grupos experimentais: CT, ECMI-S (Sensíveis ao protocolo de estresse) e ECMI-R (Resiliente ao protocolo de estresse). Para mais detalhes visualizar o cronograma experimental descrito a seguir e a figura abaixo.
Modelo animal para indução do Transtorno Depressivo Maior
Estresse Crônico Moderado Imprevisível (ECMI):
Modelos Comportamentais para Avaliação do Fenótipo do tipo Depressivo
Teste de Consumo de Sacarose
Avaliação do Estado da Pelagem
Campo Aberto (OFT)
Teste de Reconhecimento de Objetos (NORT)
Investigação do perfil de metilação do DNA:
Coleta de amostras
Após os procedimentos comportamentais com os respectivos grupos experimentais, os animais serão anestesiados com Cetamina (100mg/kg i.p.) e Xilasina (6mg/kg i.p.), (Almeida et al., 2021) para coleta do plasma via punção cardíaca, utilizando seringas de 10mL e tubos BD Vacutainer contendo EDTA com anticoagulante. Após esta coleta, as amostras de sangue serão imediatamente centrifugadas a 3.000 rpm a 4 ºC por 10 min. Após centrifugação, o plasma será separado, a capa leucocitária será coletada e armazenada em freezer -80°C para posterior extração do DNA. Em seguida, os animais terão seus cérebros dissecados e o hipocampo retirado conforme transferido para um microtubo e armazenado em -80°C (Almeida et al., 2021)
Extração de DNA leucocitário
O procedimento será realizado utilizando os leucócitos obtidos de sangue total seguindo o protocolo do kit de extração Gentra Puregene® (QIAGEN Sciences, Mayland, USA). Cerca de 0,6 mL de solução de lise das hemácias (RBC Lysis Solution, Gentra Puregene® Kit) será adicionado à amostra correspondente, em seguida será submetido a agitação por 10 minutos, temperatura ambiente. A amostra, então, será centrifugada por 5 minutos, 2.000 x g a 4°C, e o sobrenadante será cuidadosamente descartado. A amostra será agitada na solução remanescente (aproximadamente 100μl) junto com o precipitado até formação de uma solução homogênea. Posteriormente, será adicionado 1mL de solução de lise de células (Cell Lysis Solution, Gentra Puregene® Kit), as amostras serão agitadas por 20 segundos e será adicionado 50 μl de uma solução contendo enzima RNAase (Ribunuclease) na concentração de 15 mg/ml. As amostras serão incubadas por 60 minutos a 37°C. Após incubação serão adicionados solução de precipitação de proteínas (Protein Precipitation Solution, Gentra Puregene ® Kit), as amostras serão agitadas e centrifugadas a 3.000 x g por 10 minutos, 4°C. O sobrenadante será transferido para um tubo contendo isopropanol gelado, onde precipitará o DNA. A solução, após homogeneizada será novamente centrifugada por 3 minutos, 2000 x g, 4°C. Por fim, o DNA resultante será ressuspenso em 100 μl de uma solução de desferroxamina (0,1 mM) e transferido para um microtubo. A concentração do DNA será determinada pela leitura de absorbância a 260nm e sua pureza pela razão de absorbância a 260/280nm.
Extração de DNA hipocampal
Aproximadamente 25 mg de tecido serão macerados com um pistilo em um microtubo contendo 500 μl de PBS (137 mM NaCl, 2,7 Mm KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8mM KH2PO4). Em seguida, serão adicionados 30 μl de SDS 10% e 10 μl de proteinase K (10mg/mL), as amostras serão incubadas a 37°C por 24h. Após incubação, serão adicionados 400 μl de fenol (Invitrogen, Califórnia, USA) às amostras, seguido de uma centrifugação a 14.000 rpm, 4°C por 10 min. O sobrenadante será removido e transferido para novo microtubo contendo 200 μl de fenol e de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) (Invitrogen, Califórnia, USA). Este procedimento será repetido, contudo serão adicionados 400 μl de fenol e de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Posteriormente o sobrenadante será transferido para outro microtubo e 50 μl de NaAC (3M) e 1mL de etanol gelado serão adicionados. Finalizando a precipitação do DNA, as amostras serão incubadas por 2h e posteriormente centrifugadas a 14.000 rpm, 4°C por 20 min. O etanol será removido por evaporação por completo após duas lavagens. Por fim o DNA será ressuspendido em 100 μl de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) estéril. A concentração do DNA será determinada pela leitura de absorbância a 260nm e sua pureza pela razão de absorbância a 260/280nm.
Conversão por Bissulfito
Serão utilizadas alíquotas extraídas de DNA de hipocampo e leucócitos conforme descritos nos itens anteriores. A qualidade e quantidade de DNA será avaliada pelo teste de DNA Quant-TTM Picogreen®ds e mensurada no fluorômetro Oubit® (Life Technologies, NY, USA), o mínimo de DNA considerado aceitável para análise de metilação será 0,3 μg. Para conversão por bissulfito de sódio será empregado o protocolo “Zimo Gold” (EZ DNA Methylation™ Kit, Zymo research, CA, USA) conforme as especificações do fabricante.
Ensaio de Metilação do DNA - Plataforma Infinium Mouse Methylation BeadChip da Illumina 285K:
As amostras de DNA convertidas por bissulfito serão incluídas na plataforma Infinium Mouse Methylation BeadChip (Illumina, Califórnia, USA). Um total de 200 ng de DNA convertido por bissulfito será desnaturado, neutralizado e amplificado. Após precipitação com isopropanol, o DNA será recolhido por centrifugação e ressuspenso em tampão para hibridização. Em seguida, as amostras ressuspendidas serão hibridizadas nas lâminas do BeadChip a 48°C por 16 horas, seguindo o protocolo de metilação disponibilizado pela Illumina Infinium HD. As lâminas serão inseridas no scanner Illumina iScan (Illumina, San Diego, CA, USA). Os dados obtidos da leitura dos canais vermelho e verde serão convertidos em um sinal de metilado e não metilado. Após a geração do sinal um valor β entre 0 e 1 será fornecido, onde o valor 1 significa totalmente metilado (Bibikova et al., 2011). O cálculo do valor de β utilizado é realizado conforme a fórmula abaixo:
β=Max(M,0)/(Max(M,0) + Max (U,)) +100
Onde: M - sinal da sonda para CpG metilado
U- sinal da sonda para CpG não-metilado
Processamento e Interpretação dos Dados
O controle de qualidade dos dados brutos da leitura dos arrays será avaliado pelo programa R e o pacote de análise do Biocondutor WateRmelon (Pidsley et al., 2013). O primeiro passo das análises inclui a filtragem das sondas que apresentam baixa detecção de fluorescência, as sondas que apresentam valores de p < 0,05 e contagem de beads < 3 em 5% das amostras. A checagem do controle de qualidade será realizada por meio da distribuição dos sinais obtidos para sondas metiladas e não metiladas e do uso de análise multivariada MDS (Multidimensional Scaling).
Após, para ajuste do viés de cor e normalização entre as amostras será realizado o método quantile e entre sondas pelo método BMIQ (Beta-Mixture Quantile Normalization). Durante essa etapa, ocorrerá o reconhecimento das diferenças entre as sondas Infinium I e II. Para cada amostra, as sondas individuais serão classificadas como não metilada, hemimetilada (meio metilada) e metilada, conforme (Teschendorff et al., 2013).
Os valores de β serão transformados logariticamente em valores M, definido com log2 (Meth/Unmeth). A análise estatística será realizada usando valor de M, pois em comparação com o valor β há maior homocedasticidade (dados mais homogêneos e menos dispersos) (Du et al., 2010). Para essa análise será utilizada o teste de Bayes (Empirical Bayes Statistics for Differential Expression) do pacote limma (Ritchie et al., 2015).
O pacote limma será usado para identificar o perfil diferencial de metilação entre os grupos amostrais e as sondas que serão obtidas após correção do p-valor por Bonferroni (p ≤ 0,05). O MVP (Methylation Variable Positions) é um método que busca a metilação diferencial em um único sítio CpG e sua análise consiste em calcular o p-valor diferencial de metilação. Esta análise permitirá também demonstrar quantos MVPs são encontrados entre os diferentes grupos estudados. Os dados serão filtrados por um p-valor de interesse, incluindo para cada sonda, o valor médio de β para cada grupo e o valor β delta (Δβ) para os grupos usados na comparação. As posições diferentemente metiladas (DMPs) serão identificadas com valor de delta-beta (Δβ < -0,20 ou ˃ +0,20. As sondas serão anotadas de acordo com o genoma referência fornecido pela Illumina.

Com a caracterização dos padrões centrais e periféricos de metilação do DNA relacionados com a resiliência ou suscetibilidade ao estresse e suas possíveis associações com os comportamentos do tipo depressivo, será possível ampliarmos o entendimento sobre como os mecanismos epigenéticos se relacionam com a fisiopatologia da TDM. Principalmente devido ao fato de que será plausível traçarmos um perfil de metilação do DNA, que será capaz de predizer um perfil de susceptibilidade ou resiliência ao estresse, e consequentemente, ao desenvolvimento da TDM. A identificação de um padrão de alteração epigenética em amostras periféricas que reflita as alterações centrais e que expliquem as alterações comportamentais dos organismos permitirá identificarmos promissores alvos moleculares para prevenção, possíveis biomarcadores periféricos para o transtorno, ou novos alvos terapêuticos para o tratamento do TDM, o que será visto como um avanço inovador e sem precedentes nas pesquisas sobre os transtornos psiquiátricos.
Contemplando os resultados esperados deste projeto, resultarão em 2 publicações científicas de alto impacto (extrato A do QUALIS) em periódicos internacionais contando com a participação dos alunos da nossa instituição (1 mestrado e 4 Iniciações Científicas), permitindo a formação de recursos humanos altamente qualificados na pesquisa e inovação em neurociências, biologia molecular e bioinformática. Tal fato, contribuirá para a produção de conhecimento e avanço científico de tema relevante para a saúde pública. Como resultado, os estudantes envolvidos no projeto participarão em congressos científicos regionais, nacionais e internacionais onde os dados serão divulgados.
Como resultados, também, ampliaremos a inserção nacional e internacional da UFPel em pesquisas avançadas nos temas dos transtornos psiquiátricos, biomarcadores e psicofarmacologia. Com isso, buscaremos o estabelecimento de efetiva interação entre pesquisadores da UFPel (alunos de iniciação científica, de mestrado e doutorado) com renomados pesquisadores nacionais e internacionais, onde o intercâmbio de conhecimento e técnicas ampliará o pensamento crítico auxiliando no desenvolvimento da pesquisa nacional. Por fim, a partir dos dados oriundos deste projeto pretendemos buscar fomentos (nacional e internacional) através de futuros projetos que possibilitarão a realização de pesquisas clínicas a fim de concretizar a aplicabilidade dos conhecimentos pré-clínicos gerados com esta proposta. Não obstante, divulgaremos os conhecimentos científicos aqui gerados nos espaços escolares de ensino médio, entre os estudantes e professores de escolas públicas, como forma de promover a aproximação da ciência com os estudantes, oferecendo oportunidade e cativando novos talentos para a pesquisa, assim como para equipes de saúde, visando sua capacitação no entendimento da TDM.