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A esporotricose uma micose de natureza subaguda ou crônica, causada por espécies patogênicas do gênero Sporothrix, afeta humanos e animais (RODRIGUES et al., 2020). No Brasil, é uma epidemia zoonótica fora de controle, e sua transmissão ocorre majoritariamente de forma direta entre hospedeiros (BARROS et al., 2011; GREMIÃO et al., 2017).
Essa micose representa um desafio sem precedentes para a saúde pública, caracterizado pela rápida disseminação para novas áreas endêmicas, alterações na epidemiologia da doença, ocorrência de surtos e um aumento significativo no número de casos. Inicialmente concentrada nas regiões Sudeste e Sul, hoje espalha-se por todos os estados do país (RABELLO et al., 2022).
O Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz documentou mais de 5.000 casos no Rio de Janeiro envolvendo humanos, felinos e caninos ao longo de duas décadas (GREMIÃO et al., 2017; ALZUGUIR et al., 2019; GREMIÃO et al., 2020). Na mesma época, o Rio Grande do Sul, especialmente nos municípios de Pelotas e Rio Grande, emergiu como outro epicentro da doença (WALLER et al., 2018; POESTER et al., 2018; NAKASU et al., 2020; BAES PEREIRA et al., 2022). Nessa região, há uma alta incidência de esporotricose, com aproximadamente 2000 casos documentados em gatos e humanos (SANCHOTENE et al., 2015; MADRID et al., 2017; BAES PEREIRA et al., 2022). O crescente número de casos torna essa área um ponto crítico para a propagação da esporotricose não apenas no estado, mas também além de suas fronteiras. A esporotricose tem uma relação histórica com atividades agrícolas e a transmissão sapronótica do fungo em sua forma filamentosa. No entanto, a partir dos anos 1990, houve uma mudança significativa nessa dinâmica, e um aumento exponencial de casos. Desde então, a doença passou a estar mais associada aos gatos, transformando o cenário endêmico no país em uma epizootia e posteriormente em uma epidemia zoonótica (POESTER et al., 2018; ALZUGUIR et al., 2019; RODRIGUES et al., 2022).
A via de transmissão mais comum envolve contato diretos gato-humano, gato-gato e gato-cão (GREMIÃO et al., 2017; RODRIGUES et al., 2020). Na cadeia epidemiológica da doença os gatos doentes são os principais afetados e a principal fonte de infecção de Sporothrix sp., por apresentarem lesões com alta carga fúngica, e comportamentos que facilitam a inoculação do fungo (GREMIÃO et al., 2017).
A espécie fúngica predominantemente registrada no Brasil, e relacionada a esporotricose zoonótica, é Sporothrix brasiliensis (RODRIGUES et al., 2020). O aumento dramático de casos de esporotricose é parcialmente atribuído à emergência dessa espécie, altamente virulenta, responsável por alterações no padrão epidemiológico da doença e por sua disseminação acelerada entre humanos e animais (GREMIÃO et al., 2017). A sua rápida propagação pode ser comprovada através dos recentes casos envolvendo S. brasiliensis reportados na Argentina, Chile, Paraguai, Estados Unidos e Reino Unido (ETCHECOPAZ ET AL., 2020; THOMSON ET
AL., 2023; DO PRADO ET AL., 2023; KAADAN ET AL., 2020; BRANACLE ET AL., 2023). Casos de esporotricose por Sporothrix brasiliensis ocorrem predominantemente na forma de surtos (ZHANG et al., 2015, XAVIER et al., 2021), que acometem especialmente áreas com população em vulnerabilidade social (BARROS et al., 2010).
Um trabalho desenvolvido pelo Centro de Pesquisa em Micologia Veterinária, em cooperação com o Grupo de Pesquisa em Modelagem Matemática da Universidade Federal de Pelotas, indica uma progressão exponencial alarmante na incidência da esporotricose no Rio Grande do Sul, apontando para um cenário epidemiológico complexo e de difícil controle, em um curto espaço de tempo, ressaltando a necessidade urgente de adoção de estratégias de controle para mitigar a disseminação da esporotricose (BAES PEREIRA et al., 2024, no prelo).
A adaptação e rápida disseminação do agente, bem como a mudança na cadeia epidemiológica, impulsionada pela transmissão direta de Sporothrix brasiliensis, marcam um ponto de inflexão crítico na luta contra a esporotricose. Essa significativa alteração, destacada por Rodrigues et al. (2013a, 2016a), Téllez et al. (2014) e Gremião et al. (2017), apresenta desafios notáveis no controle e na eficácia do tratamento da doença. Esses desafios são ainda mais complexos devido aos hábitos e comportamento dos gatos, que aumentam o risco zoonótico para seus tutores e para os profissionais da saúde animal (XAVIER et al., 2021).
Agravando a situação, a carência de serviços veterinários públicos de saúde, os obstáculos ao acesso a tratamentos sem custo, de uma medicação com alto valor e com longo tempo de terapia, somada as dificuldades na administração dos medicamentos são fatores que aumentam o risco de falha no tratamento e de desenvolvimento de resistência antifúngica, como observado por Barros et al. (2010). Ainda, quando se considera que a população mais afetada por esta doença negligenciada vive em vulnerabilidade social, o combate a esporotricose torna-se quase inviável.
Além disso, a problemática da resistência ao itraconazol (ITZ), cada vez mais prevalente nos casos de esporotricose, ressalta a importância crítica de se monitorar tal resistência e buscar novas soluções terapêuticas antifúngicas. Esse aspecto crucial é corroborado pelos estudos de Gremião et al. (2011, 2015), Pereira et al. (2010) e Waller et al. (2021), que apontam para a necessidade de avanço nas opções de tratamento antifúngico frente à crescente resistência.
Neste contexto, o desenvolvimento de novas moléculas emerge como uma abordagem promissora, potencializando o uso de medicamentos existentes. Este projeto de pesquisa enfoca a exploração de novas moléculas para o tratamento da esporotricose, alinhado às necessidades emergentes de intervenção eficaz e avanço no combate a essa doença desafiadora.

5.1. Síntese dos Complexos de Cu(II) e Ag(I) Contendo Bases de Schiff
Reação de 1eq. do composto orgânico precursor (chamado de ligante) com 1.1 eq. do sal de cobre(II) ou sal de Ag(I) em metanol à temperatura ambiente por 3h, evaporação do solvente e purificação do sólido. Estudaremos o comportamento dos compostos em solução e o potencial redox para os complexos de Cu(II). Os compostos orgânicos e os complexos (compostos inorgânicos serão caracterizados por espectroscopia na região do IV, UV-Vis, RMN (1H, 13C), análise elementar (CHN) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS). A metodologia abordará a modificação da esfera de coordenação desses compostos, mantendo o ligante tridentado e variando o íon espectador (NO3, SO4, ClO4, OAc, I, Cl), a fim de explorar o comportamento do centro de Cu(II) e Ag(I) com diferentes ambientes químicos.
5.2. Síntese e Caracterização das Nanocápsulas
As suspensões serão preparadas através da técnica da nanoprecipitação (da ROSA et al. 2020). As nanocápsulas formadas serão caracterizadas quanto a morfologia por ME de transmissão (MET). A determinação do diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta das nanocápsulas será realizada por espalhamento de luz dinâmico. Para a determinação da eficiência de encapsulação o conteúdo no exterior da nanocápsula será determinado e o encapsulado determinado por diferença.
5.3. Análise molecular
5.3.1.Serão utilizados isolados armazenados no MICVET-UFPel, provenientes de casos de esporotricose em felinos, caninos e humanos naturalmente infectados de diversos municípios do estado do RS.
5.3.2. Caracterização molecular
Para a definição inicial da espécie, o gDNA dos isolados de Sporothix spp. serão extraídos através técnica adaptada in house utilizando Breaking buffer , Fenol: Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1) e pérolas de vidro. Os locus calmodulina(O’Donnell et al. 2000) e espaçador transcrito interno (ITS) do rDNA (Zhou et al. 2014) serão amplificados utilizando primers degenerados de CAL - CL1 ; e ITS 1 e ITS4, respectivamente. As reações serão preparadas em volume final de 25 μL: 0,2 mM de dNTPs, 1 U de Taq DNA Polimerase , 3,5 mM MgCl2, tampão 1X, 0,2 pmol de cada primer. As amostras serão amplificadas em termociclador. Os fragmentos serão sequenciados em ambas as direções, visando aumentar a qualidade dos dados. A montagem das sequências será realizada através do software Vector NTI, analisadas através da plataforma BLASTN e depositadas no GenBank.
5.4. Testes de suscetibilidade antifúngica - Determinação da concentração inibitória mínima (MIC)
5.4.1 Preparo do Meio de Cultura RPMI 1640: Para o desenvolvimento deste projeto, será preparado o meio de cultura RPMI, enriquecido com L-glutamina, isento de bicarbonato de sódio e adicionado de vermelho de fenol como indicador de pH, destinado aos ensaios de microdiluição em caldo.
5.4.2. Avaliação da MIC: A eficácia dos compostos será avaliada através de testes de MIC, realizados conforme o método de microdiluição em caldo. Este procedimento será adaptado das normativas M38-A2 (CLSI, 2008a) e M27-A3 (CLSI, 2008b), com ajustes específicos para atender às particularidades do nosso estudo.
5.4.3. Preparo de compostos :As soluções-estoque dos compostos de cobre(II) e Ag(I) contendo ligantes bases de Schiff e do itraconazolserã o preparadas com concentrações de 12,8 mg/mL e 1,6 mg/mL, respectivamente, utilizando DMSO como solvente. Para os ensaios de microdiluição em caldo, os compostos e o itraconazol em meio líquido RPMI 1640 tamponado serão diluídas para obter uma concentração final 2X superior à necessária para os testes (256 mg/L para as moléculas e 32 mg/L para o itraconazol). Serão realizadas oito diluições seriadas em meio líquido RPMI 1640 tamponado, as quais serão feitas diretamente na placa de microdiluição, estabelecendo assim as concentrações de teste para os compostos químicos, variando de 128 mg/L a 1 mg/L e para o itraconazol de 16 mg/L a 0,0125 mg/L.
5.4.4. Controle de Diluição: Para assegurar que a máxima concentração de DMSO a ser empregada nos experimentos não comprometa a viabilidade das células fúngicas, será avaliada a concentração mais elevada, após sua diluição no meio RPMI 1640 tamponado, sem adição de compostos. Esta avaliação será feita em microplaca de 96 poços, e servirá como controle de diluição em testes com isolados fúngicos.
5.4.5. Preparo Inóculo - Sporothrix sp. fase leveduriforme: As culturas serão coletadas individualmente e transferidas para tubos de ensaio, homogeneizada em vórtex por 15´´ e sua densidade óptica será medida em espectrofotômetro digital, no comprimento de onda de 530 nm, ajustando-a para transmitância de 75 a 77%. A suspensão resultante passará por diluição em duas etapas no meio RPMI 1640 tamponado: inicialmente na proporção de 1:50 e, posteriormente, na proporção de 1:20, alcançando concentração final de 1 X 10³ a 5 X 10³ UFC/mL, concentração duas vezes maior do que a requerida para o inóculo final, que deverá ser de 0,5 X 10³ a 2,5 X 10³ UFC/mL.
5.4.6. Preparo Inóculo - Sporothrix sp. fase filamentosa : As placas contendo as colônias serão lavadas com 1 mL de solução salina estéril (0,85%) adicionada de 0,1% de Tween 20. A suspensão contendo conídios e fragmentos de hifas, será transferida para um tubo de ensaio estéril, por 3 a 5 minutos para permitir a decantação. Em seguida, o sobrenadante, contendo conídios, será transferido para tubo de ensaio, homogeneizado em vórtex por 15``. A suspensão será ajustada para transmitância de 80 a 82% no comprimento de onda de 530 nm. Será realizada diluição de 1:50 da suspensão em meio RPMI 1640 tamponado acrescido de glicose, resultando em concentração final 2X mais elevada que a necessária para o inóculo final, variando de 0,4 X 10⁴ a 5 X 10⁴ UFC/mL.
5.4.7. Incubação e leitura: As microplacas serão incubadas em estufa a 37°C e, após 72 horas, a CIM será identificada visualmente, como a menor concentração dos compostos que impediram o crescimento fúngico, comparado com crescimento do controle positivo do inóculo
5.5. Avaliação de Viabilidade, Citotoxicidade e Cultivo Celular
5.5.1. Cultura de células: Células da linhagem Equine Dermis, serão cultivadas em garrafas de 25cm³ (TPP®), com 9 mL de meio E-MEM com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 0,25% de gentamicina. Para a manutenção, as células serão periodicamente dissociadas com tripsina e repicadas. Após repique, as garrafas serão mantidas em estufa a 37 °C até que o tapete celular atinja a confluência. As garrafas serão repicadas até que se obtenha a quantidade necessária para a realização do experimento.
5.5.2. Ensaio de Citotoxicidade : Será testada a viabilidade celular perante os dos compostos, conforme protocolo descrito por SILVEIRA et al., (2020). As células ED serão transferidas para microplacas de 96 poços, 4x104 céls/poço. As microplacas serão mantidas a 37°C, ambiente úmido com 5% de CO2. Após, o meio será removido e as células serão expostas a concentrações seriadas dos fármacos citados e incubadas por 24 horas/37°C, em 5% de CO2. A integridade dos compostos será verificada com microscópio invertido, após o qual o tratamento será retirado e se determinará a viabilidade celular por meio do método colorimétrico MTT, aplicando 100 uL de MTT a 0,5 mg/mL diluído em E-MEM, seguido de 4h de incubação a 37 °C em ambiente úmido com 5 % CO2. O MTT será removido e 100 μL DMSO serão adicionados para dissolver os cristais de formazan. A densidade óptica (DO) será medida com espectrofotômetro, a 540nm. A maior concentração não tóxica de cada fármaco será escolhida para testar frente ao desafio com Sporothrix spp.
5.5.3. Desafio frente a Sporothrix sp.
Para o desafio dos compostos frente a Sporothrix em cultura de células ED, utilizar-se-ão microplacas de 96 poços. Será produzida uma suspensão celular de ED em 8mL de meio E-MEM, a qual será transferida para tubos tipo Falcon e centrifugados por 30` à 1000 rpm. O pellet será ressuspenso com 10mL de meio. Se aplicará em cada poço um volume de suspensão com a concentração de 4x104 cél/mL. A quantificação das céls será realizada por meio de contagem na câmara de Neubauer. Após, adicionar-se-á cada fármaco diluído em E-MEM para a concentração escolhida no volume de 100 uL em seguida serão adicionados os inóculos de Sporothrix spp. na concentração de 1x108 conídio/mL. Como controle negativo será utilizado o meio E-MEM, como controle positivo dos fungos serão utilizadas as cepas ATCC de Sporothrix spp. e como controle dos fármacos apenas o cultivo celular com cada composto. As microplacas serão mantidas em estufa úmida de CO2 a 5%, examinadas a cada 24h até que se detecte ruptura do tapete celular. Para determinação da viabilidade celular, será utilizado o método do MTT descrito acima.
5.7. Expressão relativas de genes ligados a HOG1 (High Osmolarrity Glicerol Pathway)
O RNA total das amostras dos grupos tratados (T1 - compostos de cobre(II) contendo ligantes bases de Schiff; T2- composto de Ag(I) contendo ligantes bases de Schiff; T3 – controle Sporothrix sp. em RPMI) serão extraídos utilizando o reagente TRIZOL. O RNA total obtido será tratado com DNAse e como controle de qualidade da extração será quantificado utilizando espectrofotômetro , razão A260/A280. Para amplificar os fragmentos de regiões do DNA que codifica para HOG 1 serão utilizados os primers segundo as recomendações do fabricante. O cDNA obtido será tratado com RNAse e então 1 ul do produto será utilizado para a análise de expressão relativa utilizando os primers de interesse em termociclador.

1. Síntese e avaliação in vitro da reatividade de compostos de Cu(II) e Ag(I) contendo ligantes derivados de Bases de Schiff. Meta: estabelecer relações entre a estrutura do composto (fatores estéricos e eletrônicos, tipo de átomo doador, íon espectador, geometria) com a atividade antifúngica.

2. Avaliação da Atividade Antifúngica: realizar um conjunto abrangente de ensaios de suscetibilidade antifúngica para testar os compostos sintetizados contra isolados clínicos de Sporothrix spp.. Meta: determinar a eficácia dos compostos em diferentes isolados, visando a aplicação clínica direcionada.

3. Elucidação do Mecanismo de Ação: investigar o mecanismo de ação dos compostos mais promissores. Meta: utilizar técnicas de microscopia eletrônica e análise de expressão gênica para compreender como esses compostos afetam as células de Sporothrix spp. em nível molecular e celular.

4.Desenvolvimento e Caracterização de Sistemas de Nanoencapsulação: sintetizar e caracterizar nanocápsulas de zeína para a encapsulação eficaz dos compostos líderes e do antifúngico padrão, itraconazol. Meta: avaliar a estabilidade, capacidade de encapsulação, e liberação controlada dessas nanocápsulas, otimizando-as para maximizar a biodisponibilidade e reduzir a citotoxicidade.

5. Avaliação do Perfil de Citotoxicidade e Eficácia Terapêutica: medir a citotoxicidade dos compostos e das nanocápsulas em culturas celulares relevantes, assim como a eficácia antifúngica e a seletividade dos compostos nanoencapsulados. Meta: estabelecer a margem de segurança para uso potencial em terapias antifúngicas.

6.Análise do Tratamento Combinado: examinar os efeitos sinérgicos do tratamento combinado de compostos de Cu(II) e itraconazol em isolados de Sporothrix spp. Meta: redução significativa na concentração inibitória mínima (CIM) dos agentes, quando usados em combinação.

7. Publicar descobertas sobre moléculas antifúngicas em revistas de alto impacto e capacitar alunos de pós-graduação e graduação na pesquisa e tratamento da esporotricose. Meta: concluir quatro dissertações de mestrado e duas teses de doutorado em três anos, ampliando a expertise e o corpo acadêmico na área de tratamento antifúngico, utilizando os dados encontrados no presente projeto, avançando na linha de pesquisa dos Laboratórios envolvidos.