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O aumento da frequência e intensidade das chuvas causa eventos de alagamento que afetam aproximadamente 17 milhões de km2 de terras agrícolas em todo o mundo (Kaur et al. 2020). O Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas; IPCC, 2017) indica que eventos extremos, como chuvas fortes, tendem a se tornar mais frequentes devido às mudanças climáticas, e em consequência o aumento da ocorrência de períodos de inundação do solo. Além disso, as características do solo também influenciam a duração deste estresse, como os solos hidromórficos que quando submetidos a inundações durante o período chuvoso, apresentam deficiência de drenagem natural (STRECK et al., 2008; ANDRADE et al., 1999).
No Brasil, aproximadamente 28 milhões de hectares de solos estão sujeitos a inundações; uma parte está na região Centro-Oeste e outra na região Sul (VITORINO et al., 2001; MAGALHÃES et al., 2005). O cultivo de soja [Glycine max (L.) Merril], em áreas de várzeas vem aumentado a cada ano, onde anteriormente eram cultivadas apenas com arroz devido aos benefícios proporcionados pela rotação de culturas (RIBAS et al., 2021), porém os efeitos do estresse por alagamento dificultam o cultivo dessa leguminosa, causando muitas vezes grandes reduções de produtividade (Sathi et al., 2022).
Durante as inundações, o oxigênio não é suficiente para o sistema radicular das plantas; já que esse gás tem taxa de difusão 10.000 vezes menor na água quando comparado ao ar (ARMSTRONG et al., 1994), além da competição com microrganismos aeróbios pelo oxigênio disponível (DIAB e LIMAMI, 2016). Assim, as plantas devem reorganizar o seu metabolismo para a síntese e consumo de energia para sobrevivência nesta nova condição (PEDERSEN et al., 2017, LEON et al., 2021; JETHVA et al., 2022).
As plantas expostas ao alagamento são afetadas pela hipóxia radicular e alteram a produção de energia da via oxidativa para a produção de energia em nível de substrato durante a glicólise, reduzindo a produção de ATP e devido à ativação das vias fermentativas, apresentam grande produção de metabólitos anaeróbicos como lactato e etanol (RICARD et al., 1994). Além disso, nesta condição as plantas produzem altos níveis de espécies reativas de oxigênio (da SILVA e do AMARANTE, 2020), diminuem as trocas gasosas foliares (GARCIA et al., 2020), e reduzem a absorção de nutrientes, especialmente o nitrogênio (do AMARANTE et al., 2022), essas alterações podem causar redução do crescimento e queda na produção de grãos em plantas de soja (Agualongo et al, 2022, de Oliveira, et al., 2022).
Cerca de 5,4 milhões de hectares de terras baixas no Rio Grande do Sul poderiam ser integradas às cadeias produtivas da cultura da soja através da obtenção de genótipos mais tolerantes à hipóxia (SCOTT e NORMAN, 2000). Além disso, têm sido promissoras as estratégias de mitigação ao estresse por alagamento, como o priming, otimizando em plantas previamente tratadas (submetidas previamente ao priming por alagamento, por exemplo) o enfrentamento de um segundo evento de estresse. Os benefícios do priming podem se estender desde a otimização do consumo de carboidratos, redução da atividade fermentativa e do estresse oxidativo (Agualongo et al, 2022), além de melhora na eficiência do uso da água, proteção do aparato fotossintético, manutenção dos pigmentos fotossintéticos e menores danos foto-oxidativos em plantas tratadas com o priming (BESTER et al., 2024). A aplicação de nitrato durante o período de alagamento tem também demonstrado importantes benefícios ao aumento da tolerância das plantas de soja ao estresse hipóxico, diminuindo o estresse oxidativo, a atividade fermentativa em tecidos hipóxicos e melhorando o status energético em plantas alagadas, além de evitar reduções nas taxas fotossintéticas, nas trocas gasosas foliares e nos teores de pigmentos fotossintéticos (da Silva et al., 2020, da Silva et al., 2021). Ainda, a inoculação com microorganismos promotores de crescimento, como Azospirillum, tem demonstrado benefícios significativos às plantas de soja quando expostas ao estresse por alagamento, como por exemplo, no aumento da assimilação do nitrogênio em condição de déficit de O2 (Shimoia et al., 2023).
Apesar dos efeitos benéficos do priming por alagamento, fertilização com nitrato e utilização de bactérias promotoras do crescimento terem demonstrado melhorar o ajuste do metabolismo e crescimento das plantas de soja sob estresse hipóxico, é importante avaliar comparativamente as respostas das plantas a estes tratamentos na tolerância ao alagamento para tomada de decisões de manejo direcionadas a diversidade de condições em que os eventos de estresse possam se manifestar sobre os cultivos. Além disso, os estudos que demonstram o efeito do priming nos estádios iniciais de desenvolvimento, como a germinação, e a extensão desse nas respostas bioquímicas e fisiológicas sobre as plantas de soja quando submetidas ao alagamento em estádios de desenvolvimento posteriores, tanto vegetativo quanto reprodutivo, são ainda incipientes.
Assim, neste estudo pretende-se comparar o impacto dos tratamentos mitigadores do estresse hipóxico causado pelo alagamento do sistema radicular, a nutrição com nitrato e a inoculação com Azospirillum em plantas de soja, sobre respostas metabólicas e fisiológicas de tolerância. Ainda, este projeto tem o objetivo de verificar se esses efeitos também são plausíveis em plantas de soja oriundas de sementes submetidas ao priming por hipóxia (submersão), quando alagadas durante estádios de pleno desenvolvimento vegetativo e reprodutivo.

O projeto será desenvolvido em dois experimentos distintos, sendo que para a execução do segundo experimento serão feitos ensaios para a seleção de dois genótipos de soja com contrastes de respostas ao tratamento hipóxico. O detalhamento da metodologia está descrito abaixo:

Experimento I: Avaliação respostas bioquímicas e fisiológicas de plantas de soja ao alagamento quando associadas simbioticamente com Bradyrhizobium frente à nutrição com nitrato ou coinoculação com Azospirillum

Sementes de soja [Glycine max (L.) Merril] provenientes de cultivar sensível ao alagamento (fornecidas pelo Programa de Melhoramento Genético da Embrapa Clima Temperado) serão inoculadas com bactérias diazotróficas e semeadas em vasos de 1L contendo vermiculita esterilizada como substrato, e as plantas obtidas, serão cultivadas em condições de casa de vegetação. A nutrição das plantas será realizada com solução nutritiva de Hoagland solution (Hoagland & Arnon, 1950), com ou sem a presença de nitrogênio, dependendo do tratamento. Na solução contendo nitrogênio, o mesmo será disponibilizado na forma de nitrato.
O experimento será conduzido de forma inteiramente casualisada em esquema fatorial (3 x 2; sistemas de assimilação de N e níveis de estresse, respectivamente) com quatro repetições, onde cada unidade experimental será constituída de um vaso contendo uma planta. Serão conduzidos três tratamentos: 1) Plantas inoculadas com Bradyrhizobium (estirpes SEMIA 5079 e 5080, com 8x109 UFC/g), cultivadas na ausência de N mineral; 2) Plantas inoculadas com Bradyrhizobium e Azospirillum (cepas Ab-v5 e Ab-v6 com 2 x 109 UFC/mL), cultivadas na ausência de N mineral e 3) Plantas inoculadas com Bradyrhizobium, cultivadas na presença de N mineral fornecido na forma de nitrato (2,5 mM). Ao atingirem o estádio fenológico R5 (plantas no início do enchimento de grãos, em um dos quatro nós superiores da haste principal), as plantas serão submetidas ao alagamento por oito dias. Após esse período, os vasos serão submetidos à drenagem por quatro dias. As plantas serão alagadas, colocando os vasos dentro de recipientes sem furos e preenchidos com solução nutritiva (Hoagland) diluída para 1/3 da força, possibilitando manter uma lâmina de água acima do substrato. Para a drenagem, os vasos serão retirados destes recipientes e deixados para drenar naturalmente. Serão realizadas duas avaliações, uma ao final do período de alagamento e outra ao final do período de drenagem. Nestes períodos serão coletadas amostras de folhas e raízes para determinações bioquímicas. Serão avaliados estresse oxidativo, consumo de carboidratos, atividade fermentativa em raízes e dosagem da enzima redutase do nitrato, além de metabólitos anaeróbicos e pigmentos fotossintéticos. Concomitantemente serão avaliados nestes períodos o crescimento das plantas e as trocas gasosas.


Experimento II: Avaliação de respostas de tolerância à hipóxia em plantas de soja ao efeito do priming por alagamento quando aplicado nos estádios iniciais de desenvolvimento

Inicialmente, para se estudar o efeito do priming por hipóxia em sementes de soja, nas respostas ao alagamento aplicado nos estádios de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo das plantas, será avaliada a influência do tempo de submersão de sementes na água de pelo menos 20 genótipos, considerando variedades comerciais e linhagens desenvolvidas a partir dos programas de melhoramento da soja para cultivo em áreas de várzea, cedidas pela Embrapa Soja e Embrapa Clima Temperado. Posteriormente, a partir dos testes iniciais, serão selecionados dois genótipos (o de maior e o de menor tolerância ao tratamento de submersão) para se estudar o efeito priming.
As sementes, previamente esterilizadas, serão submetidas a três períodos de hipóxia: zero (controle); 12 horas e 24 horas, conforme metodologia proposta por MONTEIRO et al. (2014), com modificações. A hipóxia será induzida pela imersão das sementes em água deionizada e o monitoramento do teor de O2 será realizado por meio de um oxímetro. Os períodos de hipóxia serão caracterizados a partir do momento em que a concentração de O2 atingir aproximadamente 30% da concentração inicial (normóxia). Os recipientes contendo as sementes imersas serão mantidos lacrados e em temperatura ambiente pelos períodos descritos acima. Em seguida, as sementes serão secas parcialmente em papel toalha e submetidas às seguintes avaliações: teste de germinação e primeira contagem de germinação conforme BRASIL (2009); medição do comprimento das plântulas seguindo metodologia recomendada pela AOSA (1983) e adaptada por NAKAGAWA (1999) e teste de condutividade elétrica segundo VIEIRA e KRZYZANOWSKI (1999).
A partir da seleção dos dois genótipos que apresentarem maior e menor tolerância ao teste de submersão das sementes, assim como a definição do tempo de submersão, confrontando os resultados dos testes de germinação, comprimento de plântulas e de condutividade elétrica, será iniciado o experimento com priming.
Inicialmente, as sementes dos dois genótipos selecionados (sensível e tolerante), previamente expostas ao tratamento com priming e não expostas (controle) serão inoculadas com Bradyrhizobium (estirpes SEMIA 5079 e 5080, com 8x109 UFC/g) e semeadas em vasos plásticos de três litros contendo vermiculita lavada como substrato e mantidos em casa de vegetação. As plantas serão nutridas com solução Hoagland livre de nitrogênio e mantidas na proporção de duas plantas por vaso. Os dois genótipos provenientes de sementes que receberam ou não o tratamento por priming, serão submetidos ao alagamento no estádio V3 (três nós na haste principal iniciando pelo nó com unifólio) (FEHR et al., 1971) por sete dias e no estádio R2 (flor no nó imediatamente abaixo do nó mais alto com uma folha completamente desenrolada) (FEHR et al., 1971), por cinco dias. O alagamento será imposto, colocando cada vaso (com furos de drenagem) em vasos não perfurados da mesma dimensão e enchendo os vasos com 1/3 da solução nutritiva livre de N até o nível da solução atingir 2 cm acima da superfície da vermiculita. A solução nutritiva será monitorada diariamente e reabastecida quando necessário. A concentração de O2 na solução será monitorada com um medidor de O2. Após sete dias de alagamento do grupo de plantas alagadas em V3 ou cinco dias do grupo de plantas alagadas em R2, os vasos serão drenados e as plantas serão deixadas a se recuperar por cinco dias. As plantas controle não serão submetidas ao alagamento.
Nestes períodos de alagamento e de recuperação serão coletadas amostras de folhas e raízes para determinações bioquímicas. Serão avaliados estresse oxidativo, consumo de carboidratos, atividade fermentativa em raízes e de enzimas glicolíticas, além de metabólitos anaeróbicos e pigmentos fotossintéticos. Concomitantemente serão avaliados nestes períodos o crescimento das plantas e as trocas gasosas.

Análise Estatística

O experimento será realizado em um delineamento inteiramente casualisado, com unidade experimental constituída de um vaso contendo uma e quatro repetições por tratamento. Os dados serão submetidos a análise de variância (ANOVA). Quando o teste de diferença da ANOVA, F, for significativo, as médias serão comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro (p 0,05). As análises estatísticas serão realizadas por meio do programa estatístico SAS 8.0 – Statistical Software Program (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA).

- Espera-se que os benefícios obtidos pela coinoculação com Azospirillum em plantas de soja associadas com Bradyrhizobium sejam equivalentes aos obtidos pela suplementação com nitrato na manutenção das trocas gasosas (assimilação líquida de CO2, transpiração e condutância estomática) em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e em maior recuperação durante o período de reoxigenação.

- Espera-se que os benefícios obtidos pela coinoculação com Azospirillum em plantas de soja associadas com Bradyrhizobium sejam equivalentes aos obtidos pela suplementação com nitrato na manutenção dos teores de pigmentos fotossintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e em maior recuperação durante o período de reoxigenação.

- Espera-se que os benefícios obtidos pela coinoculação com Azospirillum em plantas de soja associadas com Bradyrhizobium sejam equivalentes aos obtidos pela suplementação com nitrato no alívio do estresse oxidativo em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e em recuperação (período de reoxigenação).

- Espera-se que os benefícios obtidos pela coinoculação com Azospirillum sejam equivalentes aos obtidos pela suplementação com nitrato na diminuição da atividade fermentativa em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e maior recuperação (período de reoxigenação) comparado a plantas apenas inoculadas com Bradyrhizobium.

- Espera-se que os benefícios obtidos pela coinoculação com Azospirillum sejam equivalentes aos obtidos pela suplementação com nitrato na eficiência do consumo de carboidratos resultando em maiores teores de açúcares solúveis totais e sacarose, bem como menor consumo de amido em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e durante a recuperação (período de reoxigenação) comparado a plantas apenas inoculadas com Bradyrhizobium.

- Espera-se que plantas de soja associadas com Bradyrhizobium e coinoculadas com Azospirillum apresentem menores perdas na biomassa e de produção de grãos de forma equivalente às plantas nutridas com nitrato.

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em menor inibição do crescimento das plantas e manutenção da produtividade.

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando na manutenção dos teores de pigmentos fotossintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides em plantas sob alagamento (período de hipóxia) e em maior recuperação durante o período de reoxigenação.

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em menor inibição das trocas gasosas (assimilação líquida de CO2, transpiração e condutância estomática).

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em maior capacidade em manejar o estresse oxidativo.

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em maior eficiência do metabolismo fermentativo durante o alagamento e rápido decréscimo no período de reoxigenação (recuperação).

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em maior eficiência das enzimas glicolíticas e envolvidas em reações anapleróticas da respiração celular, resultando em maiores atividades das vias que otimizem o status energético das plantas sob alagamento (período de hipóxia) e em recuperação (período de reoxigenação) comparado a plantas apenas inoculadas com Bradyrhizobium.

- Espera-se que o tratamento de submersão das sementes possa atuar como priming nas plantas de soja quando submetidas ao alagamento nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2) resultando em maior eficiência do uso de carboidratos durante o alagamento.

- Espera-se que plantas de soja oriundas de sementes previamente submetidas ao tratamento de submersão das sementes apresentem menores perdas na biomassa e de produção de grãos quando alagadas nos estádios de desenvolvimento vegetativo (V3) e reprodutivo (R2).