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A neuroinflamação é um processo que ocorre no encéfalo e na medula espinhal em certas circunstâncias, incluindo a progressão e exacerbação de distúrbios neurodegenerativos, neuropsiquiátricos e metabólicos (RANSOHOFF et al., 2015; DiSABATO et al., 2016). A inflamação no sistema nervoso central (SNC) está relacionada ao sistema imunológico e à comunicação periférica através do transporte e sinalização de moléculas como citocinas e espécies reativas de oxigênio (ROS) (DiSABATO et al., 2016; WALKER et al., 2014). Quando as citocinas são produzidas em níveis elevados, elas podem se infiltrar na barreira hematoencefálica através de locais específicos por certos mecanismos de transporte (WALKER et al., 2014). Esta via imuno-cérebro está causalmente relacionada à microglia, células imunes inatas pela natureza do mecanismo neuroinflamatório (DiSABATO et al., 2016). Todos esses eventos podem levar à neurotoxicidade e morte celular (SHABAB et al., 2017). Levando em consideração que a neuroinflamação está presente em diversas doenças do SNC, estudos mimetizando tal alteração são de suma importância, o que pode resultar em esclarecimentos a respeito deste tão importante mecanismo, bem como na elucidação no potencial terapêutico de vários compostos naturais como o extrato padronizado de Ilex paraguaiensis.
A erva-mate (I. paraguariensis A. St. Hilaire) é um produto alimentar de consumo diário por parcelas significativas da população do Sul do Brasil, Argentina, Paraguai, Uruguai. A indústria ervateira é parte de um complexo do agronegócio, tendo nos estados do Sul um mercado consolidado, e um mercado potencial nos estados do Sudeste e região Central do Brasil, seja com o hábito do chimarrão, do tererê ou como chá-mate (VALDUGA, 2002). Sua utilização popular na forma de infusão ou macerada está intimamente ligada ao fato de apresentar propriedades diuréticas, digestivas e estimulantes do SNC (DERMARDEROSIAN, 2001). Além destas propriedades ligadas ao uso popular, cabe destacar que diversas outras potenciais atividades farmacológicas já foram investigadas e descritas para I. paraguariensis, como as atividades antioxidante (FILIP et al., 2000; SCHINELLA et al., 2000), antiobesidade (PANG et al., 2008), antidiabética (OLIVEIRA et al., 2008) e anticarcinogênica (RAMIREZ-MARES et al., 2004). Quanto à composição química, diversos grupos de metabólitos secundários já foram descritos para a erva-mate, como as metilxantinas, cafeína e teobromina, os ácidos fenólicos, os quais encontram-se em grande concentração nesta espécie vegetal, como o ácido clorogênico, neo-clorogênico e o ácido tricafeoilquínico. Adicionalmente, estão presentes os flavonoides rutina, campferol, quercetina (FILIP et al., 2001).
Considerando a complexidade química do mate, é importante destacar que o balanço entre a concentração de diferentes substâncias interfere nas propriedades fisiológicas da erva-mate. Por exemplo, uma maior concentração de cafeína pode promover ação pro-oxidante (ANESINI et al., 2012). Por outro lado, os compostos fenólicos apresentam forte correlação positiva com a capacidade antioxidante (ANESINI et al., 2012).
Desta forma, com este trabalho pretendemos ampliar os estudos já iniciados pelo nosso grupo de pesquisa buscando caracterizar novos compostos naturais biologicamente ativos capazes de interagir de forma mais específica com componentes fisiopatológicos da neuroinflamação, contribuindo assim para o desenvolvimento de terapêuticas mais eficazes e com efeitos adversos mínimos para as doenças neuroinflamatórias.

A atividade neuroprotetora e anti-inflamatória do extrato padronizado de Ilex paraguariensis (fornecido pelo professor Flávio Reginatto - UFSC) será avaliada por meio de estudos in vitro em cultura de astrócitos exposta ao lipopolissacarídeo (LPS) bem como, em modelos animais de neuroinflamação.
Inicialmente, o projeto será realizado em cultivo primário de astrócitos para avaliação de citotoxicidade. Para isso, serão utilizados ratos Wistar neonatos (1-3 dias) obtidos do Biotério Central da UFPel. O córtex cerebral será removido, homogeneizado e centrifugado. As células serão submetidas ao protocolo de proteção frente ao insulto com LPS. Para isso, os astrócitos serão tratados com o extrato nas concentrações de 3 – 1000 µg/mL por 24h ou 48h (BELLAVER et al., 2015). Posteriormente, serão expostos ao LPS (1 µg/mL) durante três horas. As células mantidas apenas em DMEM com 10% de SFB serão consideradas como controle. A partir disso, o sobrenadante e o lisado das células serão armazenados para os ensaios posteriores (parâmetros de estresse oxidativo, marcadores inflamatórios).
Nos estudos in vivo, camundongos Swiss adultos (60 dias de vida) serão divididos nos seguintes grupos: I controle; II- Extrato 50 mg/kg; III- Extrato 100 mg/kg; IV- LPS (500 µg/kg); V- LPS + extrato 50 mg/kg; VI- LPS + extrato 100 mg/kg. O protocolo experimental de neuroinflamação e tratamento com extrato irá durar duas semanas, com os animais recebendo água ou extrato por 14 dias nas doses de 50 e 100 mg/kg por via oral (gavagem). Entre o 8º e o 14º dia, os animais dos grupos receberão também veículo (solução salina 0,9%) ou LPS (500 µg/kg) por via intraperitoneal. A dose do LPS foi baseada em estudos prévios (ALZAHRANI et al., 2022; ÖZ & ERDAL, 2024). Nos dias 14 e 15, os animais serão submetidos a testes comportamentais para avaliação da atividade locomotora, memória de curto e longo prazo, ansiedade. Em seguida, os animais serão anestesiados e eutanasiados e amostras coletadas para as determinações bioquímicas.
Dentre os parâmetros que serão avaliados destacam-se:
Testes comportamentais
Campo aberto: Os animais serão submetidos ao teste do campo aberto. Para a sua execução, inicialmente, os animais serão colocados individualmente em um dos quatro cantos do campo aberto, permanecendo pelo período de 5 minutos no aparato. Esse aparato consiste em uma arena quadrada medindo 56 x 40 x 30 cm, sendo a base dividida em 12 quadrados (12 x 12 cm). Durante os 5 minutos, serão registrados a latência para o primeiro movimento, a frequência de ambulação nos quadrantes centrais e periféricos, rearings, groomings, além do número de bolos fecais (ZHU et al., 2016).
Reconhecimento de objetos: Os animais serão submetidos ao teste de reconhecimento de objetos 24 horas após a realização do teste do campo aberto e no mesmo aparato. Nesse teste, os animais serão colocados individualmente no aparato com dois objetos idênticos (objetos A1 e A2), durante 5 minutos, a fim de explorá-los livremente (treino). Após 2 horas, para avaliar a memória de curto prazo, os animais serão colocados novamente na caixa, porém um objeto antigo será trocado por um novo (objeto B) e o animal poderá explorá-los por 5 minutos. Os objetos a serem utilizados na tarefa serão de plástico (Lego) e ficarão dispostos numa posição simétrica dentro do aparato. Tanto o aparato quanto os objetos serão limpos entre cada sessão de treino ou teste com etanol 40% para remover qualquer resíduo ou odor. Só será considerado que o rato explorou quando o mesmo cheirar ou tocar os objetos com o focinho e/ou com as patas dianteiras. Os resultados serão expressos através do índice de reconhecimento para cada animal, calculado através da razão TB/(TA+TB), TA = tempo de exploração do objeto familiar A e TB = tempo de exploração do objeto novo B (ROSSATO et al., 2007).
Labirinto em Y: Esse teste usa um aparato composto por 3 braços, sendo que cada braço será escolhido aleatoriamente como braço inicial (A), braço novo (B) e outro braço (C). Esse teste possui uma sessão de treino na qual o animal é colocado no braço inicial do aparato, sendo-lhe permitido explorar os braços A e C por 5 minutos. O braço novo permanecerá fechado durante toda a sessão de treino. Após 2 horas, o braço novo será aberto e o animal poderá explorar os três braços durante 5 minutos. O aparato será limpo com etanol 40% após cada sessão individual de treino ou teste. O tempo gasto em cada braço será determinado e os resultados serão expressos como tempo gasto no braço novo e número de entradas no braço novo (DELLU et al. 1997).
Labirinto em cruz elevado: Será realizado para a avaliação do comportamento ansiolítico dos animas conforme descrito por HUYNH et al. (2011). Para esse teste os animais serão colocados no centro do labirinto em cruz elevado e poderão explorar o aparato durante 5 min. O número de entradas no braço aberto e no braço fechado será contabilizado durante esse período.
Marcadores de estresse oxidativo
Determinação de espécies reativas de oxigênio: A formação de ERO será determinada segundo ALI et al. (1992).
Determinação da concentração de nitrito: A quantificação do nitrito formado será realizada através da reação de Griess (HUANG et al., 2009).
Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico: A análise para a determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) será realizada pelo método de ESTERBAUER e CHEESEMAN (1990). Os resultados serão expressos em nmol de TBARS/mg de proteína.
Determinação do conteúdo tiólico total: A determinação do conteúdo tiólico total será realizada pelo método de AKSENOV e MARKESBERY (2011). Os resultados serão expressos em nmol de TNB/mg de proteína.
Determinação da atividade da SOD: Será determinada segundo o método descrito por MISRA e FRIDOVICH (1972) e os resultados serão expressos em unidades/mg de proteína.
Determinação da atividade da CAT: Será verificada através do método descrito por AEBI (1984) e os resultados serão expressos em unidades/mg de proteína.
Determinação da atividade da AChE: Será determinada de acordo com o método descrito por ELLMAN et al. (1961). A atividade da enzima será expressa em μmol AcSCh/h/mg de proteína.
Determinação da atividade da Na+, K+-ATPase: Será realizada pelo método descrito anteriormente por CARVALHO et al. (2018). A atividade específica da Na+,K+-ATPase será calculada através da diferença entre a atividade insensível à ouabaína da atividade geral (na ausência da ouabaína) e os resultados serão expressos em nmol de Pi/min/mg de proteína.
Determinação de citocinas: A quantificação das citocinas será avaliada pela técnica de ELISA através kits comerciais de acordo com as instruções do fabricante.
Sistema purinérgico: As ectonucleotidades serão avaliadas conforme descrito por CARVALHO et al. (2018).

A potencialidade das plantas para o desenvolvimento de fármacos e matérias-primas farmacêuticas fundamenta-se no tripé biodiversidade, tolerabilidade e mercado econômico (ZUANAZZI & MAYORGA, 2010; NEWMAN, 2008; BALUNAS & KINGHORN, 2005). Nos últimos anos, a procura por drogas vegetais como recurso terapêutico tem aumentado. Entre os fatores que motivam este aumento estão a insatisfação com os resultados obtidos com a terapêutica atual, os efeitos indesejáveis e prejuízos causados pelo uso abusivo e/ou incorreto dos medicamentos, a consciência ecológica e a crença popular do uso de compostos naturais como ferramenta de prospecção (BALUNAS & KINGHORN, 2005). A materialização destes pontos passa pelo estudo de plantas com grande potencialidade como a erva mate devido as suas características de acumuladora de compostos ativos e fisiologicamente importantes na manutenção da homeostasia corporal (BLUMENTHAL & BRINCKMANN, 2000; DERMARDEROSIAN, 2001).
Os resultados obtidos poderão abrir novos caminhos incitando tanto os estudos agronômicos de produção e propagação, como estudos farmacêuticos no desenvolvimento de novos instrumentos terapêuticos.