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A segurança alimentar global enfrenta ameaças decorrentes de perdas nas colheitas ocasionadas principalmente plantas daninhas, patógenos e insetos. Estes fatores bióticos emergem como uma das ameaças agrícolas mais onerosas, acarretando em severas perdas de produtividade que podem inviabilizar economicamente a operação de colheita.
Desde meados do século passado, os agrotóxicos sintéticos ganharam importância crescente no controle das pragas. Com a introdução de culturas transgênicas, observou-se uma redução no número de empresas dedicadas à pesquisa e descoberta de novas moléculas. Esse cenário contribuiu para a ausência de lançamentos de produtos com novos mecanismos de ação. Adicionalmente, o uso ao longo de vários anos, resultou em pragas resistentes aos agrotóxicos anteriormente eficazes, demandando a identificação de compostos com novos mecanismos de ação, a fim de suplementar ou até mesmo substituir os compostos que perderam eficácia no controle.
A exploração de estratégias que compreendem produtos biológicos e novas moléculas tornou-se essencial para o manejo sustentável de sistemas agrícolas. A variabilidade estrutural das fitotoxinas presentes na natureza, oferece uma fonte rica de compostos que podem ser utilizadas no desenvolvimento de produtos naturais como novos mecanismos de ação.
Há plantas com destacado destacado potencial como fonte de compostos bioativos. Estas plantas, são plantas daninhas infestante das plantações de arroz irrigado, e são notáveis pelo seu rápido crescimento em ambientes aquáticos com alta luminosidade e temperaturas elevadas, bem como pela capacidade de desenvolvimento de novos ramet ou folhas sem incidência de patégenos. Como resultado, ela possui o potencial de ocupar rapidamente espaços disponíveis ou novos nichos. A capacidade de ocupação do nicho pela espécie pode estar associada à sua habilidade de produzir metabólitos especializados, incluindo compostos com atividade herbicida e fungicida.
Embora nenhum sistema analítico único possa cobrir todo o metaboloma, as estratégias atuais dependem de abordagens baseadas em espectrometria de massa ou ressonância magnética nuclear (RMN). A avaliação do perfil de metabólitos pode ser conduzida por meio de cromatografia líquida (LC) e/ou cromatografia gasosa (GC) acopladas à espectrometria de massas (MS). A análise do perfil metabólico de plantas por LC-EM é uma abordagem utilizada para identificar o perfil de metabólitos especializados, como fenilpropanoides, terpenoides e alcaloides.
Considerando que estudos fitoquímicos têm sido fundamentais para a descoberta de moléculas com aplicação na agricultura e, dado o grande número de compostos naturais que serviram como base para diversos agrotóxicos, há justificativa para explorar mais profundamente o potencial como fonte de compostos com atividade biológica.
A adoção de compostos naturais, como agrotóxicos surge como uma alternativa inovadora para diminuir a dependência da agricultura em relação aos agrotóxicos sintéticos. Assim, a identificação dos compostos químicos presentes nas plantas é de extrema importância para o desenvolvimento de novos produtos naturais ecologicamente sustentáveis, destinados ao manejo eficaz e ambientalmente responsável das plantas daninhas e patógeno.

O projeto será desenvolvido nos Laboratórios de Biometria e Dinâmica de Herbicidas do Centro de Herbologia onde serão prospectados, caracterizados, sintetizados, testados e validados o(os) composto(s) responsável(is) pela atividade herbicida e fungicida.

I. Bioensaio de extração
Os compostos provenientes das folhas, colmos, meristemas e raízes secas serão extraídos com hexano (2,5 L x 3 vezes) a temperatura ambiente sob agitação durante duas horas. Os extratos provenientes das três extrações serão combinados e filtrados em funil de Buchner contendo papel filtro Whatman Nº 1. O solvente será removido por evaporação a vácuo usando evaporador rotativo (Buchi Rotavapor®) a 40 ºC. O resíduo remanescente após a extração com hexano será extraído com acetato de etila e sucessivamente com metanol, utilizando a mesma metodologia da extração com hexano.

II. Efeito herbicida de extratos sobre a geminação de sementes
Será avaliado o efeito herbicida de extratos de diferentes partes (folha, colmo, meristema e raiz) em sementes de arroz (Oryza sativa), capim-arroz (Echinochloa crusgalli) e angiquinho (Aeschynomene indica). O delineamento experimental será o inteiramente casualizado, com quatro repetições.
Os tratamentos consistirão das seis concentrações do extrato mais ativo (0 mg mL-1 (0 ppm), 3 mg mL-1 (3000 ppm), 6 mg mL-1 (6000 ppm), 9 mg mL-1 (9000 pmm), 12 mg mL-1 (12000 ppm)) e, os controles serão: água destilada, Tween 80 (5%) e o herbicida imazapique+imazapir.
As sementes passarão por teste de germinação prévio para obtenção do percentual de germinação delas. A temperatura de condução será de 20º C a 25º C dependendo da espécie e o fotoperíodo será de 12 horas. Serão analisadas as contagens de germinação (%), índice de velocidade de germinação (IVG), comprimento da raiz e da parte aérea (mm).
Os dados obtidos serão submetidos à análise da variância (p≤0,05). Havendo significância estatística, os tratamentos serão comparados pelo teste de Duncan e e serão comparados com as testemunhas pelo teste de Dunnett à 5%.

III. Efeito fungicida de extratos sobre fungos
Após a determinação da fração mais ativa, serão realizados os estudos de concentrações, onde serão testadas concentrações de 0 mg mL-1 (0 ppm), 0,25 mg mL-1 (250 ppm), 0,5 mg mL-1 (500 ppm), 1 mg mL-1 (1000 pmm), 2 mg mL-1 (2000 ppm) do extrato ativo sobre o crescimento de Biporalis oryzae, Pyricularia oryzae, Fusarium graminearum e Bipolaris Sorokiniana isolado intermediário agressividade classificados quanto a agressividade por MOREIRA-NUNEZ, (2017).
Os tratamentos consistiram em extrato ativo e os controles BDA, BDA+DMSO. O delineamento experimental será inteiramente casualizado contendo seis repetições. As unidades experimentais consistirão em placas de Petri contendo 10 mL de meio de crescimento. Para a obtenção da concentração desejada, a solução contendo o extrato será misturada com meio BDA fundente, previamente autoclavado, e a mistura vertida em placas de Petri. No centro de cada placa de Petri contendo meio BDA+tratamento solidificado, será adicionado um disco de 5 mm de cada patógeno (isolado de agressividade intermediária). As placas de Petri serão seladas com Parafilm® e levadas à câmara de crescimento onde serão mantidas em câmara de crescimento a 25 °C com fotoperíodo de 12 horas/luz/dia durante sete dias, até o momento da avaliação.
Serão realizados estudos de germinação de esporos em extrato ativo. Em cada unidade experimental representada por células da placa de titulação, será adicionado 100 μL de solução das concentrações do extrato ativo mais 100 μL da solução de esporos de Biporalis oryzae, Pyricularia oryzae, Fusarium graminearum e Bipolaris sorokiniana isolado intermediário. Será realizada a contagem de esporos não germinados, 24 horas após tratamento, e será determinado a porcentagem de inibição da germinação.
Os dados serão submetidos à análise da variância (p≤0,05) e em caso de significância estatística será realizada a comparação dos tratamentos com os controles através de contrastes de médias, sendo as concentrações, submetidas a análise de regressões não-lineares utilizando o programa Sigma Plot (SIGMAPLOT, 2012).

IV. Identificação dos compostos
- Identificação dos compostos por GC-EM
As análises em CG-EM serão realizadas com os extratos hexano sem derivatização e hexano, acetato de etila e metanol derivatizados de folhas, colmos, meristemas e raízes. Durante a extração com hexano será adicionado 100 μL do padrão interno antrona (1 mg mL-1). No processo de derivatização, após concentrar 200 μL dos extratos hexano, acetato de etila e metanol, será adicionado 100 μL de MSTFA [N metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida], e será agitado durante 60 minutos a 65 ºC. A reação será transferida para inserts de 100 μL em vials, e injetadas imediatamente no CG-EM.
Os compostos identificados serão comparados a três bancos de dados: Golm Metabolome Database (GMD: http://gmd.mpimp-golm), MassBank Europa (https://massbank.eu/MassB) e Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST: https://webbook.nist.gov). Após a integração dos picos, os dados serão normalizados de acordo com o padrão interno de cada amostra antes de serem combinados e listados.

- Identificação de compostos por LC-EM
A separação cromatográfica será realizada em cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência (UPLC). A análise de espectrometria de massa será realizada em um equipamento Thermo Q Exactive Focus (ThermoFisher) operado nos modos de ionização positivo e negativo
O processamento dos dados será realizado pelo software Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Científico, Waltham, MA, EUA). A identificação putativa dos compostos obtidos por LC-EM, será realizada comparando os valores m/z, espectro de massas e o perfil de fragmentação (MSn) com informações contidas em diferentes bases de dados livres disponíveis: GNPS (Global natural products social molecular) (https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp), Metlin (https://metlin.scripps.edu/index.php), Kegg compounds
(http://www.genome.jp/kegg/compound/), PubChem
(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), Cfm-id (http://cfmid.wishartlab.com/identify) e Mass bank (http://www.massbank.jp/QuickSearch.html) com uma precisão de massa de 10 ppm.
Para a identificação de alguns compostos fenólicos, serão utilizados padrões comerciais. Além disso, os compostos serão caracterizados pelo espectro no UV/VIS (220-800 nm), tempo de retenção relativo ao padrão externo, espectro de massas e perfil de fragmentação (MSn).

V. Purificação dos compostos
Os extratos obtidos terão seu perfil químico estudado a partir do uso das técnicas de cromatografia gasosa e/ou cromatografia líquida, ambas acopladas a espectrômetro de massas. Após a caracterização química, os extratos serão fracionados com o intuito de identificar os possíveis compostos bioativos. Para isso, as técnicas de cromatografia em coluna e/ou placa preparativa serão empregadas. De modo complementar, para auxiliar na elucidação estrutural das biomoléculas, as técnicas de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H) e de carbono-13 (13C) serão também empregadas.

VI. Síntese do composto
Após a identificação dos compostos bioativos, e considerando a necessidade do desenvolvimento de métodos economicamente viáveis para a obtenção dos biodefensivos agrícolas, serão propostas alternativas sintéticas para a obtenção dos respectivos produtos naturais. Os produtos sintéticos serão obtidos em laboratório no LASOL (Laboratório de síntese orgânica limpa) e/ou em empresas especializadas para a síntese de compostos sintéticos. Para isso, serão utilizadas metodologias sintéticas eficientes, seletivas e ambientalmente amigáveis. As reações serão acompanhadas por cromatografia em fase gasosa, camada fina e por RMN de 1H e 13C. A purificação dos produtos será realizada por cromatografia em coluna, destilação e/ou recristalização. Após a obtenção dos produtos, os mesmos serão caracterizados por RMN de 1H e 13C, infravermelho, CG/EM e espectrometria de massas de alta resolução.

VII. Validação do efeito herbicida de extratos sobre a geminação de sementes de plantas daninhas
Será realizada a validação do efeito do composto purificado e sintetizado em sementes de arroz (Oryza sativa), capim-arroz (Echinochloa crusgalli) e angiquinho (Aeschynomene indica).
Os tratamentos serão caracterizados pelas concentrações e um controle apenas com água destilada. A metodologia dos testes, as variáveis avaliadas e análise dos dados serão idênticos ao descrito no item II.

VIII. Validação da patogenicidade sobre fungos in-vitro
Após a purificação e síntese do composto mais ativo em atividade fungicida serão realizados os estudos de concentrações, onde serão testadas concentrações de 0 mg mL-1 (0 ppm), 0,25 mg mL-1 (250 ppm), 0,5 mg mL-1 (500 ppm), 1 mg mL-1 (1000 pmm), 2 mg mL-1 (2000 ppm) sobre o crescimento de Biporalis oryzae, Pyricularia oryzae, Fusarium graminearum e Bipolaris Sorokiniana de isolado intermediário. Para a obtenção destas concentrações, serão realizadas diluições a partir de uma solução do composto sintetizado.
O delineamento experimental será inteiramente casualizado contendo seis repetições e os tratamentos serão caracterizados pelas concentrações e um controle apenas com BDA. As unidades experimentais consistirão em placas de Petri contendo 10 mL de meio de crescimento. Para a obtenção da concentração desejada, a solução contendo o composto sintetizado será misturada com meio BDA fundente, previamente autoclavado, e a mistura vertida em placas de Petri.
As avaliações que serão realizadas para caracterização dos sintomas causados pela aplicação do composto purificado e sintetizado serão as mesmas descritas anteriormente no item III.
Os dados dos estudos serão submetidos à análise da variância (p≤0,05). Em caso de significância estatística será realizada a comparação entre os tratamentos dos estudos pelo teste de Duncan.

Comprovar qual é o extrato mais ativo referente a sua atividade herbicida e assim caracterizar os sintomas fitotóxicos nas sementes.
Identificar a concentração mínima do extrato que resulta em uma atividade herbicida significativa.
Comprovar qual é o extrato mais ativo referente a atividade fungicida e assim caracterizar os sintomas causados nos patógenos.
Identificar a concentração mínima do extrato que resulta em uma atividade fungicida significativa.
Isolar um composto de extrato com atividade herbivida e/ou fungicida.
Confirmar a identificação dos compostos através de experimentos adicionais e comparação com padrões conhecidos.
Encaminhar para o composto isolado para síntese.
Comprovar a ação herbicida e fungicida dos composto sintetizado.