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A PCR-HRM já foi utilizada para a diferenciação e tipagem de cepas de Mycoplasma spp., porém foram métodos desenvolvidos para amostras específicas, não sendo validada a extrapolação para espécies de outros hospedeiros (JEFFERY et al. 2007; GHORASHI; NOORMOHAMMADI; MARKHAM, 2010; REBELO; PARKER; CAI, 2011; AZARI et al., 2019). Também, não foram encontrados trabalhos referentes a este método para testagem de amostras de felinos.

Para o desenho dos primers, visando distinguir as espécies de Mycoplasma spp., o banco de dados GenBank, do National Center of Biotecnology Information (NCBI), será utilizado para obtenção das sequências de DNA referentes ao gene 16S rDNA de Mycoplasma spp. As sequências selecionadas serão analisadas e alinhadas utilizando o software Mega11 (Tamura, Stecher, and Kumar, 2021), escolhendo um ponto promissor para a síntese de primers. O produto de PCR será predito e analisado pelo software AmpliFx (Inst Neurophysiopathol, Marseille, France). Para evitar a formação de dímeros e reações ineficientes, as propriedades termodinâmicas e interações primer-primer serão avaliadas usando os softwares Oligo-Explorer v1.2 e Oligo-Analyzer v1.1.2 (Gene LinkTM, EUA). A especificidade dos primers e se eles anelam no genoma dos hospedeiros será aferida utilizando a ferramenta Primer-BLAST do NCBI. Os primers selecionados serão sintetizados pela Sigma-Aldritch (Merck KgaA, EUA).
Serão utilizadas amostras recebidas pelo serviço de extensão do Laboratório de Biologia Molecular Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (LaBMol-Vet), pelo Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal de Pelotas e de outros grupos de pesquisa parceiros do Laboratório. Também, será utilizado DNA sintético para a prova de conceito e da análise e complementação de amostragem para espécies de Mycoplasma spp. que não forem obtidas. O DNA será armazenado em -20 °C até futuras análises. As amostras serão quantificadas utilizando Thermo Scientific NanoDrop Lite (THERMO FISHER SCIENTIFIC, MA, EUA).
Para a realização do PCR-HRM, será utilizado o reagente HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (ROX), 5x (Solis Biodyne, Tartu, EE). A concentração mais eficiente de primers será analisada por diluições seriadas, de 0,08 µM até 0,25 µM, seguindo as recomendações do fabricante. O PCR em tempo real será realizado o termociclador Bio-Rad CFX Opus-96 (BIO-RAD; CA; EUA). Os resultados serão analisados no software Precision Melt Analysis Software (BIO-RAD, CA, EUA), para realizar o HRM. Para posterior confirmação de resultados, os produtos do serão sequenciados pela ATCGene Análises Moleculares pelo método de Sanger. Os resultados fornecidos pela empresa serão sujeitos a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) utilizando o banco de dados do GeneBank (NCBI)

Buscamos com esse projeto desenvolver um método molecular padronizado que ofereça uma detecção rápida e precisa de Mycoplasma spp. em animais, com um maior acurácia diagnóstica visando sensibilidade e especificidade maiores do que as encontradas em outros testes diagnósticos. Alem disso, buscamos a publicação de artigos na área e o depósito de patentes de inovação referentes ao diagnostico.