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A realização deste projeto é justificada pela necessidade de aprimorar o diagnóstico da ehrlichiose canina, uma das principais doenças transmitidas por carrapatos em cães no Brasil. A infecção por Ehrlichia canis pode levar a quadros clínicos graves, e a dificuldade em identificar a doença precocemente devido aos sinais clínicos inespecíficos contribui para a subnotificação e subdiagnóstico da enfermidade
A crescente proximidade entre animais domésticos, silvestres e seres humanos tem facilitado o intercâmbio de vetores e patógenos, tornando agentes como Ehrlichia spp., entre outros, de grande relevância tanto para a medicina veterinária quanto para a medicina humana(CORNEJO et al., 2024). D
A Elisa é uma ferramenta acessível e rápida que em conjunto com outras provas moleculares como a IFI e a PCR (AZIZ et al., 2023). tem sido um pilar importante no diagnóstico da doença (GUTIÉRREZ; PÉREZ-YBARRA, 2016), sendo importante indicador da exposição do cão ao patógeno. Existem vários ensaios aperfeiçoados em técnicas de ELISA, que são práticos para o uso diário nas clinicas veterinárias e em lugares carentes de infraestrutura laboratorial para a realização de exames que ajudem a detecção do patógeno (GUTIÉRREZ; PÉREZ-YBARRA, 2016).
Um exemplo disso são os teste com proteína GP19, que age como um potencial antígeno para detectar anticorpos de E. canis em soro de cães, ja testada anteriormente por OLIVEIRA et al.(2015) facilitando a detecção de anticorpos contra o patógeno causante desta doença, na fase aguda e depois da primeira semana após infeção em contraste com outras proteínas como GP36 ou testes que tem uma reatividade após 2 ou 3 semanas pos infecção, segundo o anteriormente dito, é preciso continuar desenvolvendo estudos em técnicas de Elisa que possam permitir um rápido diagnostico e um tratamento precoce que melhore o prognóstico de recuperação dos cães infectados, sendo a proteína recombinante GP19 promissória para esse fim (DE OLIVEIRA et al., 2015).

Coleta e processamento de amostras

No período de janeiro a dezembro de 2024, serão coletadas de forma aleatória amostras de soro em tubos sem EDTA, de cães atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias (HCV), da Universidade Federal de Pelotas. As quais serão centrifugadas a 2000 rpm durante 10 min e armazenadas a - 20 °C. As amostras de soro serão submetidas análise mediante técnica de ELISA com aproteína GP19.

Diagnostico

As técnicas diagnósticas serão realizadas no Laboratório de Biologia Molecular Veterinária (LabMol-Vet), da Faculdade de Veterinária da UFPel. Mediante técnicas serológicas, Elisa. Para isto vai ser produzida a proteína GP19, a qual é expressa em Escherichia coli cepa BL21-C41(DE3). Serão utilizadas todas as amostras de soros coletados e os dados obtidos se armazenaram em uma base de dados digital.

Para a produção da proteína GP19 segundo (DE OLIVEIRA et al., 2015), será coletada uma colônia de E. coli de uma placa recém-preparada. Em seguida, para a transformação e propagação do DNA plasmidial, será feita uma inoculação em um meio LB estéril contendo CaCl2 a 100mM e DNA plasmidial. Essa mistura será combinada com a colônia de células frescas. Para o choque térmico, o conjunto será colocado em gelo por 15 minutos, seguido por um banho-maria a 42 °C por 1 minuto, e depois uma nova incubação no gelo por 2 minutos. Após isso, serão adicionados 500 μL de meio, e a cultura será incubada a 37 °C por 1 hora. Finalmente, a cultura será transferida para um tubo Falcon de 50 mL contendo meio LB com antibiótico. A cultura crescerá durante a noite a 37 °C com agitação em um shaker a 180 RPM. Em seguida, será transferido um pré-inóculo de 0,5 mL para um tubo Falcon (50 mL) com 5 mL de meio LB líquido, 5 μL de ampicilina, e será incubado por um período de 4 a 5 horas, até atingir um valor de D.O.600nm entre 0,6 e 0,8.



Consequentemente, 1 mL de cultivo pré-indução será incubado no shaker a 37 °C, 180 RPM por 3 horas, e o restante da cultura receberá 4,5 μL de IPTG (Isopropyl β-D-1-tiogalactopiranose) 0,5-1 M (concentração final de 0,5-1 mM/mL) e será incubado a 37 °C, 180 RPM por 3 horas. No final, 1 mL de cultivo pós-indução será coletado. As amostras vão ser centrifugadas a 7.000 x g por 10 min a 4 °C, e o sobrenadante descartado, consequentemente, a lavagem do pellet em 50 mL de PBS-1x e suspensão em 40 mL μL de Wash Buffer (AKtaWash puro, 5 mM de imidazol) sem desnaturante, adpos disto, sonicado com 7 pulsos de 30 s com 45 s de intervalo, centrifugado a 15.000 x g por 40 min A 4 °C finalmente o sobrenadante será coletado e filtrado em 0.8 μM para purificar.

Para a purificação a coluna vai ser preparada com 5 mL de H2O MiliQ, 1ml de NiSO4 0,1M, 5 mL de H2O MiliQ, 5 mL de Akta Wash puro ( 5mM de imidazol), 20-30 mL do filtrado, 20 mL de Akta Wash Puro (lavagem , 20mM imidazol) com um gradiente de eluição ( 3 mL cada 0: 5, 10, 15, 20 e 100% em AktaWash e Elution puro, o lavagem da coluna sera feito com 7 mL de Akta elution 100%, 5ml de H2O MiliQ, 5ml de etanol 20% e mantido em um recipiente úmido a 4 °C, sendo analisado em um SDS-Page 12% da purificação.

Para a dialise com a proteína já confirmada por SDS-Page, será preparada a membrana e lavada em agua até sair o resíduo externo da membrana, segurando no saco de dialise , depositando a membrana em um becker contendo1-2 L de de PEG 30% para a concentração do líquido ate 1/3 ou metade do volume inicial, finalmente as proteínas serão alíquotadas em eppendorfs e armazenadas a -20 °C.Por último será realizado o método de ELISA jápadronizado por (DE OLIVEIRA et al., 2015)

Espera-se, com este trabalho, a obtenção de resultados satisfatórios quanto ao desenvolvimento de um teste rapido que facilite o diagnostico de E. canis no hospital veterinário da UFPEL. A detecção sorológica de E. canis. Consequentemente, promovendo a divulgação dos dados obtidos sobre o teste desenvolvido para o meio acadêmico e para os médicos veterinários.