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Apesar de dados de campo indicarem uma frequência relevante de falhas reprodutivas associadas à Neospora caninum, ainda há necessidade de investigar potenciais efeitos sobre a qualidade, danos celulares e a viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro após congelamento e o descongelamento.

3.1 Produção in vitro de embriões bovinos

Será realizada a partir do Manual de Produção in vitro de Embriões Bovinos do
Laboratório de Reprodução Animal da Empresa Brasileira de Agropecuária
(Embrapa) Clima Temperado - Estação Experimental Terras Baixas.
Meios comerciais serão preparados conforme as instruções do fabricante, no dia anterior a cada etapa (com exceção do meio LAV e MIV, preparados no mesmo dia), sendo eles: meio LAV, meio MIV, meio
H-199 com BSA, meio FIV base, meio FIV gotas e meio CIV. Além disso, também foi
utilizado óleo mineral Irvine da mesma fabricante sobre as gotas de MIV e CIV nas
placas nunc.

3.1.1 Obtenção de oócitos e maturação in vitro

Os oócitos serão colhidos em abatedouro local e transportados para o
laboratório em solução salina fisiológica (0,9% de cloreto de sódio) e mantidos em
temperatura média de 30°C. Os oócitos serão transferidos para um becker previamente
aquecido em banho-maria (30°C) contendo soro fisiológico, O recipiente será
colocado novamente em banho maria até a aspiração.

A aspiração dos complexos cumulus-oócitos (CCOs) a partir do líquido folicular germinativo será conduzida utilizando bomba de vácuo, com agulha calibre 19G, selecionando folículos de 0,2mm a 0,8mm durante 1h (Boni et al., 1999). O líquido folicular coletado será colocado em tubos
cônicos de 15mL e mantido sob aquecimento de 37°C em banho seco por pelo
menos 20min para sedimentação do material. Posteriormente, será conduzida a procura dos oócitos em estágio de vesícula germinativa (VG) em microscópio estereoscópico, a partir do precipitado resultante. O pellet do líquido folicular será depositado em placa de petri para procura e o sobrenadante centrifugado
para ser utilizado como diluidor para facilitar a procura (De Loss et al., 1989). Os CCOs serão selecionados conforme as suas características morfológicas: íntegros, citoplasma homogêneo e com células do cumulus compactas (grau I e grau II). os oócitos serão lavados em duas gotas de meio LAV e uma gota de meio MIV (Boni,2002).

Os CCOs selecionados foram depositados em gotas de 400uL de meio MIV
cobertas com óleo mineral, em placas nunc de 4 poços (estabilizado por pelo menos
2 horas em estufa de 5% de CO2), sendo colocados 30 oócitos por gota. Os oócitos
permanecem no meio de maturação por um período de 22 a 24h à 39ºC em estufa
com 5% de CO2, com composição atmosférica de 20% de O2 (Boni, 2002).

3.1.2 Preparação espermática e fertilização in vitro

Posteriormente, no dia seguinte, o ocorrerá início da preparação espermática, utilizando palhetas de sêmen congelado de uma única partida de touro Nelore, fornecidas por empresa comercial. As amostras serão descongelados em banho-maria a 36ºC por 30 segundos. A motilidade espermática será avaliada em microscópio de óptica em dois momentos distintos: antes do tratamento e após o tratamento de seleção
espermática.

A seleção será realizada através do gradiente de densidade de Percoll, utilizando o Mini Percoll (1,5mL), na qual permite a recuperação espermática de até 50% através da centrifugação em gradiente descontínuo (Zúccari et al., 2008). O gradiente será preparado entre 1h-2h anterior a preparação espermática, utilizando as concentrações de 90 e 45%, dispostos nesta ordem no microtubo na quantidade de 200uL cada, e mantidos em estufa de 5% de CO2. O sêmen será colocado sobre o gradiente e centrifugado por 6 min a 6000 rpm.

O pellet criado será homogeneizado juntamente com 1mL de meio FIV Base, e novamente centrifugado por 3 min a 3000 rpm. O sobrenadante foi descartado e mantido 150uL do mesmo com o pellet para homogeneização. Para calcular a dose inseminante, uma amostra de 5uL de sêmen será retirada
para a avaliação da concentração espermática e contagem dos espermatozóides em câmara de Neubauer, e ajustada para dose inseminante 1,0 x 10⁶ espermatozóides/mL.

O cálculo realizado consiste em: Dose inseminante = Volume da gota de FIV / Nº de espermatozoides. O resultado será corrigido por regra de três de acordo com a motilidade observada .
Simultaneamente à preparação dos espermatozoides, os oócitos serão lavados em gotas de meio H-199 e meio FIV, respectivamente. Após, os oócitos serão depositados em gotas de 400uL de meio FIV em placa nunc. Os espermatozóides serão depositados sobre os oócitos nestas gotas e incubados por
18h-20h a 39ºC em estufa de 5% de CO2.

3.1.3 Cultivo in vitro

Foi realizada a lavagem dos prováveis zigotos em gota de meio LAV após serem retirados da placa nunc de FIV e realizado desnudamento com o auxílio de “vórtex” com pipeta p200, o desnudamento tem como objetivo retirar células do cumulus que estão ainda nesse momento aderidas aos prováveis zigotos após a
FIV.

Após será feita a lavagem em gota de meio LAV e CIV, e transferidos para gotas de meio CIV em placa nunc para iniciar a etapa de cultivo. As gotas na placa foram de 100uL cada e coberta com óleo mineral Irvine, e incubados a 39ºC em estufa de 5% de CO2, a baixa tensão de oxigênio proporciona um menor estresse oxidativo (Grázia, 2019).

3.1.4 Avaliação dos embriões in vitro

Os embriões serão avaliados a partir do estágio de desenvolvimento, sendo: não fertilizado; 2–8 células; 8–16 células; mórula inicial; mórula compacta; blastocisto inicial; blastocisto e blastocisto expandido, e a qualidade dos embriões (grau I - excelente; grau II - bom; grau III - regular; e grau IV - degeneração). Os
embriões classificados como graus I, II e III serão considerados viáveis e as estruturas avaliadas com grau IV serão consideradas inviáveis.

3.2 Cultivo de células Vero

O cultivo celular será realizado a partir de linhagem de células estabelecidas, de rim de macaco africano, chamadas de células Vero. As células apresentam características similares às células do epitélio: forma poligonal, crescimento aderente, formando uma camada contínua no frasco de cultivo, a monocamada.
Serão preparadas garrafas estéreis de 25cm³ para cultivo celular que irão receber as células da garrafa "mãe", bem confluente.

O meio de cultivo será descartado e será adicionado 1 mL de tripsina sobre o tapete celular por 30 segundos. A tripsina será utilizada para remover células aderentes dos frascos, e as passagens serão identificadas com números seqüenciais, relativos ao número de vezes que o cultivo
foi transferido para outro frasco (218). Após, a tripsina será retirada , observando-se as
células redondas em suspensão e adicionado mais 1 mL de tripsina sobre o tapete celular, e incubado a 37 °C por 10 min.

Posteriormente, o tapete celular será solto, pipetando a tripsina sucessivamente sobre o mesmo por cerca de 15 vezes, As alíquotas da garrafa “mãe” foram depositadas em novas garrafas de 25cm³ e cultivadas em meio de crescimento Eagle, Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM), com o pH 7,4-7,6 e suplementadas com soro fetal bovino 10% cobrindo o futuro tapete celular, e incubadas as garrafas fechadas em estufa com 5% de CO2 a 37°C, verificando o desenvolvimento do tapete celular diariamente no microscópio invertido para avaliação do crescimento celular, como a adesão das células e formação da
monocamada.

3.2.1 Cultivo de Neospora Caninum em células Vero

Conforme Venâncio et al. (2022), os taquizoítos do protozoário Neospora Caninum serão cultivados em monocamada estabelecida de células Vero a 37°C em 5% de CO2, trocando todo o meio de cultura, sem adição de soro fetal bovino. Os frascos serão observados diariamente durante o período de cultivo dos
protozoários e os meios trocados conforme a necessidade, avaliada através da coloração do meio de cultivo.

O monitoramento do cultivo do protozoário será realizado com a observação dos frascos em um microscópio invertido, para analisar a multiplicação do Neospora caninum dentro das células ou livre
no meio, os efeitos citopáticos causados na monocamada de células Vero e o comportamento dos parasitas nas células.

Será utilizada uma garrafa repleta de taquizoítos, com 50-90% do tapete celular
destruído, homogeneizando todo o conteúdo da garrafa pipetando-o sucessivamente, e passar de 1-2 mL do homogeneizado para cada nova garrafa de cultivo celular a ser inoculada. Após 24h de cultivo, será possível observar os cistos, até que a célula não suporte a quantidade de parasitas e rompa. No dia 5-6, a coleta é feita de todo o conteúdo da garrafa, sendo homogeneizado por uma agulha de calibre 27G, com a
finalidade de romper células que ainda abrigassem taquizoítos.

O volume swerá centrifugado a 1.500rpm por 10min e o sobrenadante descartado. O pellet foi
ressuspendido em meio MIV/FIV/CIV, dependendo da etapa de infecção. A contagem dos taquizoítos será feita utilizando câmara de Neubauer, com a concentração para 3x10⁶ taquizoítos/mL, a fim de definir a solução infectante e infectar o oócito ou possível zigoto (Venâncio et al., 2022).

Espera-se a detecção do Neospora caninum em diferentes estágios
embrionários e identificação da etapa mais suscetível a infecção, ocasionando
redução na taxa de clivagem, menor formação de blastocistos expostos ao
protozoário, causando efeitos citopáticos, analisando possíveis danos estruturais a
partir de microscopia eletrônica. Detecção do DNA do Neospora caninum nos
embriões infectados por meio de técnicas de PCR e identificação da localização do
protozoário utilizando técnica de imunofluorescência, sugerindo os pontos de
interação ou colonização.

Os resultados dessa proposta deverão viabilizar a condução de uma dissertação de mestrado.