Nome do Projeto
Uso do Vetor Viral TRV e Levantamento de Vírus em Plantas Daninhas
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
30/01/2025 - 30/01/2028
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O setor agrícola desempenha um papel fundamental na economia do Brasil, impactando diretamente a produção e, indiretamente, diversos outros setores. Como qualquer área produtiva, enfrenta desafios significativos, como a resistência das pragas aos pesticidas e a crescente demanda por alternativas que reduzam o uso de agrotóxicos, visando a proteção da saúde humana e ambiental. Nos últimos anos, têm surgido novas abordagens para o controle de pragas, especialmente por meio de métodos moleculares. O silenciamento de genes, utilizando a aplicação exógena de RNA(RNAi), tem se mostrado uma tecnologia promissora para superar a resistência aos pesticidas e controlar pragas. Entretanto, uma das principais limitações dessa tecnologia é a dificuldade de entregar os RNAs de maneira eficaz no alvo biológico. Especificamente em plantas daninhas, o conhecimento genômico é mais recente quando comparado ao das plantas de importância econômica, o que torna necessário o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a análise funcional de genes, a fim de identificar potenciais alvos para o controle dessas plantas. O objetivo deste projeto é validar e explorar o uso do vetor TRV (Tobacco rattle virus) para estudar genes alvos envolvidos na resistência e/ou diferenciação em plantas daninhas. Além disso, pretende-se realizar um levantamento de vírus presentes em plantas daninhas, com o intuito de identificar vírus que possam ser utilizados no futuro, para desenvolver ferramentas biotecnológicas que possam ser usadas na área da herbologia.
Objetivo Geral
Utilizar a tecnologia de VIGS em plantas daninhas e procurar vírus em plantas daninhas que possam servir como modelos para construir um vetor viral.
Justificativa
- O vetor viral TRV pode ser eficiente na análise funcional de genes em plantas daninhas;
- O vetor viral TRV permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência e diferenciação nas plantas daninhas;
- Vírus presentes em plantas daninhas podem servir como vetores virais.
- O vetor viral TRV permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência e diferenciação nas plantas daninhas;
- Vírus presentes em plantas daninhas podem servir como vetores virais.
Metodologia
ESTUDO 1- Vetor viral TRV em plantas daninhas
Mudas de plantas: Serão utilizadas 20 mudas de cada uma das seguintes espécies: Amaranthus sp. (Caruru), Raphanus sp. (Nabiça), Conyza sp. (Buva), Eragrostis plana (Capim-Annoni) e Nicotiana benthamiana (controle positivo). As plantas serão cultivadas sob condições controladas, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, e temperatura variando entre 20ºC e 25ºC. Cinco dias antes da agroinfiltração, as plantas serão aclimatadas a uma temperatura constante de 22ºC.
Clones TRV: Os clones utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Laboratório de Virologia do Departamento de Microbiologia Agrícola da Universidade Federal de Viçosa (UFV), sob a coordenação da Professora Poliane Alfenas Zerbini. O clone pTRV1 corresponde à construção que contém o fragmento referente ao RNA1 do Tobacco rattle virus (TRV), enquanto o clone pTRV2_PDSt é uma construção que contém o fragmento modificado do RNA2 do TRV, juntamente com o gene da fitoeno desaturase (PDS) de tabaco. Ambos os clones foram transformados na cepa Agrobacterium tumefaciens C58C1. Considerando que o gene PDS é constitutivo, espera-se que, mesmo com a sua utilização, as plantas agroinfiltradas apresentem características fenotípicas distintas, decorrentes do silenciamento do gene alvo.
Agroinoculação: Para a obtenção dos pré-inóculos, os clones descritos anteriormente serão cultivados em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) líquido, suplementado com 40 mg/L de kanamicina e 40 mg/L de rifampicina, e incubados a 28°C por 20 horas com agitação de 225rpm. Em seguida, 1 mL de cada pré-inóculo será transferido para Erlenmeyers contendo 50 mL de meio LB líquido, com a mesma composição de antibióticos, sendo incubado sob as mesmas condições de temperatura e agitação até atingir uma densidade óptica (OD600) aproximada de 0,6. Após esse período, as células bacterianas serão coletadas por centrifugação e resuspendidas em tampão de inoculação contendo 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MES e 200 μM de acetosiringona, até atingir uma OD600 de 1,2. As suspensões bacterianas serão mantidas a temperatura ambiente por pelo menos 2 horas e, em seguida, misturadas na proporção de 1:1. Utilizando uma seringa de 5 mL, as suspensões serão inoculadas nas folhas das plantas, que serão mantidas a uma temperatura constante de 22ºC durante o período de observação fenotípica.
Análise fenotípica das plantas: As plantas serão monitoradas e fotografadas diariamente a fim de verificar uma mudança fenotípica, um aspecto de branqueamento nas folhas devido ao silenciamento do gene PDS. Esperando o aparecimento das primeiras alterações 15 dias após a agroinoculação e acompanhando as mudanças até 45 dias após a agroinoculação.
Detecção do TRV nas plantas agroinfiltradas: Será realizado um RT-PCR como um primeiro screening para detectar a presença das duas moléculas de RNA do TRV, trinta dias após a agroinoculação. A extração de RNA total será realizada a partir de 100mg de tecido foliar utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen). O RNA total extraído será tratado com DNase (Promega) por 1 hora a 37˚C a fim de remover qualquer contaminante de DNA genômico. Após o tratamento será realizada a síntese de cDNA utilizando-se primers específicos para a detecção do TRV (Shen et al., 2021). Para a síntese de cDNA, o RNA tratado com DNase (aproximadamente 1 g) será utilizado em uma reação contendo 1 µl do primer reverse e água suficiente para um volume final de 14 µl. A reação será incubada à 70°C por 5 minutos. Decorrido o tempo serão adicionados à reação 5 µl de tampão (Tris-HCl 250 mM pH 8,3, KCl 375 mM e MgCl2 15 mM), 5 µl de mistura de deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 10mM e 200 unidades da transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen). A mistura será incubada a 42oC por 1 hora. Para a amplificação via PCR serão utilizados oligonucleotídeos específicos (Shen et al., 2021)
ESTUDO 2- Levantamento de vírus em plantas daninhas
Plantas alvo: Serão realizadas coletas de amostras foliares das seguintes espécies de plantas daninhas: Conyza spp. (buva), Amaranthus viridis (caruru), Cyperus haspan (tiririca), Ipomoea acuminata (corda de viola), Sida glaziovii (guanxuma), Digitaria insularis (capim amargoso) e Eragrostis plana (capim-annoni).
Coleta das amostras: Amostras foliares, tanto sintomáticas quanto assintomáticas, serão coletadas e acondicionadas em caixas térmicas contendo gelo. Posteriormente, as amostras serão transferidas para um ultrafreezer a -80ºC, onde serão armazenadas para posterior processamento. Adicionalmente, será realizado o georreferenciamento dos pontos de coleta, a fim de registrar com precisão a localização exata das amostras.
Diagnose de virus: Para a diagnose serão feitos testes moleculares para as especies virais pertencentes aos gêneros: begomovirus, potyvirus, rabdhovirus, ipomovirus e tospovirus.
a. Extração de ácidos nucleicos: A extração de RNA total será realizada a partir de 100mg de tecido foliar utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen). A extração de DNA total será a partir de discos foliares de acordo com o método desenvolvido por Doyle e Doyle (1983).
b. Testes diagnósticos:
b.1.Vírus com Genoma de DNA: A detecção de begomovirus será realizada por PCR utilizando primers degenerados (Rojas et al. 1993). A reação será conduzida com 30 ciclos, cada um consistindo de uma desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 54ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, seguido de uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. O produto amplificado será analisado por eletroforese em gel de agarose (0,8% p/v). Posteriormente, o produto será enviado para sequenciamento.
b.2. Vírus com Genoma de RNA: Para os vírus com genoma de RNA, o RNA extraído será utilizado para a síntese de cDNA utilizando o kit SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. A transcrição reversa será realizada com primers específicos para os gêneros mencionados acima. O cDNA obtido será então utilizado como molde em reações de PCR, empregando oligonucleotídeos forward e reverse específicos. Posteriormente, o produto será enviado para sequenciamento.
Mudas de plantas: Serão utilizadas 20 mudas de cada uma das seguintes espécies: Amaranthus sp. (Caruru), Raphanus sp. (Nabiça), Conyza sp. (Buva), Eragrostis plana (Capim-Annoni) e Nicotiana benthamiana (controle positivo). As plantas serão cultivadas sob condições controladas, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, e temperatura variando entre 20ºC e 25ºC. Cinco dias antes da agroinfiltração, as plantas serão aclimatadas a uma temperatura constante de 22ºC.
Clones TRV: Os clones utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Laboratório de Virologia do Departamento de Microbiologia Agrícola da Universidade Federal de Viçosa (UFV), sob a coordenação da Professora Poliane Alfenas Zerbini. O clone pTRV1 corresponde à construção que contém o fragmento referente ao RNA1 do Tobacco rattle virus (TRV), enquanto o clone pTRV2_PDSt é uma construção que contém o fragmento modificado do RNA2 do TRV, juntamente com o gene da fitoeno desaturase (PDS) de tabaco. Ambos os clones foram transformados na cepa Agrobacterium tumefaciens C58C1. Considerando que o gene PDS é constitutivo, espera-se que, mesmo com a sua utilização, as plantas agroinfiltradas apresentem características fenotípicas distintas, decorrentes do silenciamento do gene alvo.
Agroinoculação: Para a obtenção dos pré-inóculos, os clones descritos anteriormente serão cultivados em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) líquido, suplementado com 40 mg/L de kanamicina e 40 mg/L de rifampicina, e incubados a 28°C por 20 horas com agitação de 225rpm. Em seguida, 1 mL de cada pré-inóculo será transferido para Erlenmeyers contendo 50 mL de meio LB líquido, com a mesma composição de antibióticos, sendo incubado sob as mesmas condições de temperatura e agitação até atingir uma densidade óptica (OD600) aproximada de 0,6. Após esse período, as células bacterianas serão coletadas por centrifugação e resuspendidas em tampão de inoculação contendo 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MES e 200 μM de acetosiringona, até atingir uma OD600 de 1,2. As suspensões bacterianas serão mantidas a temperatura ambiente por pelo menos 2 horas e, em seguida, misturadas na proporção de 1:1. Utilizando uma seringa de 5 mL, as suspensões serão inoculadas nas folhas das plantas, que serão mantidas a uma temperatura constante de 22ºC durante o período de observação fenotípica.
Análise fenotípica das plantas: As plantas serão monitoradas e fotografadas diariamente a fim de verificar uma mudança fenotípica, um aspecto de branqueamento nas folhas devido ao silenciamento do gene PDS. Esperando o aparecimento das primeiras alterações 15 dias após a agroinoculação e acompanhando as mudanças até 45 dias após a agroinoculação.
Detecção do TRV nas plantas agroinfiltradas: Será realizado um RT-PCR como um primeiro screening para detectar a presença das duas moléculas de RNA do TRV, trinta dias após a agroinoculação. A extração de RNA total será realizada a partir de 100mg de tecido foliar utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen). O RNA total extraído será tratado com DNase (Promega) por 1 hora a 37˚C a fim de remover qualquer contaminante de DNA genômico. Após o tratamento será realizada a síntese de cDNA utilizando-se primers específicos para a detecção do TRV (Shen et al., 2021). Para a síntese de cDNA, o RNA tratado com DNase (aproximadamente 1 g) será utilizado em uma reação contendo 1 µl do primer reverse e água suficiente para um volume final de 14 µl. A reação será incubada à 70°C por 5 minutos. Decorrido o tempo serão adicionados à reação 5 µl de tampão (Tris-HCl 250 mM pH 8,3, KCl 375 mM e MgCl2 15 mM), 5 µl de mistura de deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 10mM e 200 unidades da transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen). A mistura será incubada a 42oC por 1 hora. Para a amplificação via PCR serão utilizados oligonucleotídeos específicos (Shen et al., 2021)
ESTUDO 2- Levantamento de vírus em plantas daninhas
Plantas alvo: Serão realizadas coletas de amostras foliares das seguintes espécies de plantas daninhas: Conyza spp. (buva), Amaranthus viridis (caruru), Cyperus haspan (tiririca), Ipomoea acuminata (corda de viola), Sida glaziovii (guanxuma), Digitaria insularis (capim amargoso) e Eragrostis plana (capim-annoni).
Coleta das amostras: Amostras foliares, tanto sintomáticas quanto assintomáticas, serão coletadas e acondicionadas em caixas térmicas contendo gelo. Posteriormente, as amostras serão transferidas para um ultrafreezer a -80ºC, onde serão armazenadas para posterior processamento. Adicionalmente, será realizado o georreferenciamento dos pontos de coleta, a fim de registrar com precisão a localização exata das amostras.
Diagnose de virus: Para a diagnose serão feitos testes moleculares para as especies virais pertencentes aos gêneros: begomovirus, potyvirus, rabdhovirus, ipomovirus e tospovirus.
a. Extração de ácidos nucleicos: A extração de RNA total será realizada a partir de 100mg de tecido foliar utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen). A extração de DNA total será a partir de discos foliares de acordo com o método desenvolvido por Doyle e Doyle (1983).
b. Testes diagnósticos:
b.1.Vírus com Genoma de DNA: A detecção de begomovirus será realizada por PCR utilizando primers degenerados (Rojas et al. 1993). A reação será conduzida com 30 ciclos, cada um consistindo de uma desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 54ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, seguido de uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. O produto amplificado será analisado por eletroforese em gel de agarose (0,8% p/v). Posteriormente, o produto será enviado para sequenciamento.
b.2. Vírus com Genoma de RNA: Para os vírus com genoma de RNA, o RNA extraído será utilizado para a síntese de cDNA utilizando o kit SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. A transcrição reversa será realizada com primers específicos para os gêneros mencionados acima. O cDNA obtido será então utilizado como molde em reações de PCR, empregando oligonucleotídeos forward e reverse específicos. Posteriormente, o produto será enviado para sequenciamento.
Indicadores, Metas e Resultados
Metas:
- Validar o uso do vetor viral TRV para o silenciamento de genes em plantas daninhas;
- Contribuir para o avanço da gênomica das plantas daninhas;
- Iniciar um levantamento de virus em plantas daninhas.
Resultados esperados:
- O uso do TRV como vetor viral para o silenciamento de genes possibilitará a identificação e validação de genes essenciais nas plantas daninhas, que estão envolvidos na resistência a herbicidas e/ ou no processo de diferenciação celular que contribuem para sua adaptação e sobrevivência;
- Esse levantamento e posterior identificação e caracterização de vírus associados a plantas daninhas, podem ser utilizados para a construção de vetores virais eficientes e específicos para o controle dessas plantas;
- Apresentar uma ferramenta alternativa de ánalise de genes mais rápida que não necessita de transformação de plantas e nem de melhoramento convencional para obter resultados;
- Treinamento de recursos humanos em nível de graduação, mestrado e doutorado em trabalhos com vírus e vetores virais;
- Publicação de artigos científicos em revistas de elevado impacto.
- Validar o uso do vetor viral TRV para o silenciamento de genes em plantas daninhas;
- Contribuir para o avanço da gênomica das plantas daninhas;
- Iniciar um levantamento de virus em plantas daninhas.
Resultados esperados:
- O uso do TRV como vetor viral para o silenciamento de genes possibilitará a identificação e validação de genes essenciais nas plantas daninhas, que estão envolvidos na resistência a herbicidas e/ ou no processo de diferenciação celular que contribuem para sua adaptação e sobrevivência;
- Esse levantamento e posterior identificação e caracterização de vírus associados a plantas daninhas, podem ser utilizados para a construção de vetores virais eficientes e específicos para o controle dessas plantas;
- Apresentar uma ferramenta alternativa de ánalise de genes mais rápida que não necessita de transformação de plantas e nem de melhoramento convencional para obter resultados;
- Treinamento de recursos humanos em nível de graduação, mestrado e doutorado em trabalhos com vírus e vetores virais;
- Publicação de artigos científicos em revistas de elevado impacto.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| ALEXANDRE DE LIMA CAETANO | |||
| DANIELLE RIBEIRO DE BARROS | 4 | ||
| EMANUELI BIZARRO FURTADO |