Nome do Projeto
Isolamento e detecção de DNA de leptospiras em amostras de animais abatidos em frigoríficos do RS
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
14/02/2025 - 31/12/2028
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
A leptospirose é uma doença tropical emergente negligenciada. Para a agropecuária, a enfermidade causa grande impacto econômico, resultando em graves prejuízos para os produtores e, conseqüentemente, para a economia do país, devido principalmente aos transtornos reprodutivos nos animais de produção. Dados oficiais referentes à ocorrência da enfermidade em animais no Brasil ainda são escassos. A prevalência sorológica em animais é estimada em torno de 35%, sendo que mais de 80% das propriedades rurais podem apresentar casos da doença. Além disso, estudos revelaram que 5 a 10% dos trabalhadores de frigoríficos possuem anticorpos contra sorovares leptospirais, confirmando a importante relação ocupacional de veterinários, magarefes e produtores rurais com a enfermidade. Neste contexto, propõe-se o isolamento e detecção de DNA de leptospiras em amostras de animais abatidos em frigoríficos do RS. Assim, este estudo possibilitará a execução de estudos sorológicos, epidemiológicos e moleculares nos rebanhos da região, além de contribuir o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose animal.
Objetivo Geral
Geral
Isolar Leptospiras e detectar DNA em amostras de animais abatidos em frigoríficos do RS.
Específicos
Isolar Leptospiras da urina e dos rins de animais abatidos em frigoríficos do RS;
Isolar cepas pertencentes aos sorovares Hardjo, Pomona e Grippotyphosa, importantes causadores da leptospirose animal no Brasil e no mundo;
Detectar DNA leptospiral na urina e rins de animais abatidos em frigoríficos do RS;
Classificar as leptospiras isoladas utilizando o sequenciamento de DNA.
Isolar Leptospiras e detectar DNA em amostras de animais abatidos em frigoríficos do RS.
Específicos
Isolar Leptospiras da urina e dos rins de animais abatidos em frigoríficos do RS;
Isolar cepas pertencentes aos sorovares Hardjo, Pomona e Grippotyphosa, importantes causadores da leptospirose animal no Brasil e no mundo;
Detectar DNA leptospiral na urina e rins de animais abatidos em frigoríficos do RS;
Classificar as leptospiras isoladas utilizando o sequenciamento de DNA.
Justificativa
A leptospirose é uma doença global de grande relevância, afetando tanto humanos quanto animais, especialmente no setor agropecuário, onde causa impactos econômicos significativos devido a perdas produtivas e reprodutivas. A elevada incidência da leptospirose no Brasil e a exposição ocupacional de trabalhadores de frigoríficos, veterinários e produtores rurais em atividades laborais ocupacionais reforçam a importância de estudos aprofundados nesta área. A diversidade de cepas de Leptospira isoladas em Pelotas evidencia a complexidade da doença na região e destaca a necessidade urgente de pesquisas para o controle da leptospirose em animais de produção, bem como para o desenvolvimento de vacinas e diagnósticos mais eficazes. Adotar uma abordagem de Saúde Única, que integra a saúde humana, animal e ambiental, é essencial para compreender e mitigar os impactos da leptospirose, garantindo a sustentabilidade da agropecuária e a proteção da saúde pública.
Metodologia
Amostras:
Para a coleta de amostras, foram escolhidos frigoríficos da cidade de Pelotas e região. Os critérios para a escolha dos estabelecimentos incluíram localização, rotina de abate das principais espécies animais e disponibilidade do serviço de inspeção durante as coletas. Rins serão coletados aleatoriamente na linha de abate, após a inspeção realizada pelo médico veterinário responsável. Após a limpeza e cuidadoso manuseio do órgão, será realizado um corte e o mesmo será acondicionado em um recipiente plástico estéril, identificado e armazenado em uma caixa térmica apropriada para o transporte.
Meio de Cultura:
O meio de cultura utilizado será o meio EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) da Difco, amplamente utilizado para o cultivo de Leptospiras, tanto em apresentações líquidas quanto semi-sólidas. O meio base será preparado em frascos de vidro previamente esterilizados, com ajuste de pH entre 7,2 e 7,4, ideal para o crescimento de Leptospira spp. Após a mistura dos componentes, o meio será esterilizado em autoclave a 121°C por 15 minutos. Em seguida, o meio será resfriado em banho-maria até atingir 40°C, momento em que serão adicionados suplementos essenciais, como soro de coelho (10% do volume total), agentes detoxificantes como Tween 40 ou Tween 80, e inibidores de crescimento de contaminantes, como 5-Fluorouracil (100 a 200 μg/mL), para o isolamento seletivo de Leptospiras. Para o meio semi-sólido, será adicionado agar em concentração de 0,1% a 0,2%, conferindo consistência adequada para o crescimento das Leptospiras sem interferir na mobilidade. O meio seletivo será distribuído em tubos plásticos de 50 mL, devidamente lacrados e identificados, sendo armazenados sob refrigeração (4°C). Antes do uso, será realizada a prova de esterilidade, incubando-se os tubos a 30°C por 24 a 48 horas para garantir a ausência de contaminantes. A viabilidade do meio será testada com a repicagem de cepas de Leptospiras previamente cultivadas no laboratório, seguindo os protocolos de rotina.
Processamento das Amostras:
Após a coleta, o material será transportado imediatamente ao laboratório em condições de refrigeração controlada, para garantir a preservação das amostras. No laboratório, dentro de uma cabine de fluxo laminar previamente esterilizada, as amostras serão manipuladas utilizando instrumentais cirúrgicos estéreis, como bisturis, tesouras e pinças, para garantir a assepsia. Fragmentos de aproximadamente 2-3 cm³ do tecido renal serão removidos assepticamente e transferidos diretamente para um tubo contendo meio de cultura líquido EMJH, já preparado e esterilizado. Os tubos serão incubados em uma estufa bacteriológica a 29°C, temperatura ideal para o crescimento de Leptospira spp., e monitorados semanalmente. Durante este período, serão realizadas avaliações tanto macro quanto microscópicas para verificar o crescimento bacteriano, utilizando microscopia de campo escuro. Posteriormente, as amostras de Leptospira serão enviadas para um laboratório de referência, onde será realizada a identificação do sorogrupo e sorovar por meio de técnicas como aglutinação microscópica (MAT) e PCR específica para sorovares.
PCR e Sequenciamento do DNA:
Todas as culturas positivas serão submetidas à análise por reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção de Leptospira. A extração do DNA será realizada utilizando kits comerciais adequados para extração de DNA bacteriano, que têm demonstrado alta eficiência na purificação de DNA de amostras de Leptospira. Os primers utilizados serão específicos para a amplificação de segmentos de genes conservados em espécies de Leptospira, seguindo protocolos amplamente descritos na literatura recente. As condições da reação de PCR incluirão ciclos de desnaturação, anelamento e extensão conforme recomendados pelos fabricantes dos kits e descritos por autores recentes, garantindo uma amplificação robusta do DNA leptospiral.
Para a coleta de amostras, foram escolhidos frigoríficos da cidade de Pelotas e região. Os critérios para a escolha dos estabelecimentos incluíram localização, rotina de abate das principais espécies animais e disponibilidade do serviço de inspeção durante as coletas. Rins serão coletados aleatoriamente na linha de abate, após a inspeção realizada pelo médico veterinário responsável. Após a limpeza e cuidadoso manuseio do órgão, será realizado um corte e o mesmo será acondicionado em um recipiente plástico estéril, identificado e armazenado em uma caixa térmica apropriada para o transporte.
Meio de Cultura:
O meio de cultura utilizado será o meio EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) da Difco, amplamente utilizado para o cultivo de Leptospiras, tanto em apresentações líquidas quanto semi-sólidas. O meio base será preparado em frascos de vidro previamente esterilizados, com ajuste de pH entre 7,2 e 7,4, ideal para o crescimento de Leptospira spp. Após a mistura dos componentes, o meio será esterilizado em autoclave a 121°C por 15 minutos. Em seguida, o meio será resfriado em banho-maria até atingir 40°C, momento em que serão adicionados suplementos essenciais, como soro de coelho (10% do volume total), agentes detoxificantes como Tween 40 ou Tween 80, e inibidores de crescimento de contaminantes, como 5-Fluorouracil (100 a 200 μg/mL), para o isolamento seletivo de Leptospiras. Para o meio semi-sólido, será adicionado agar em concentração de 0,1% a 0,2%, conferindo consistência adequada para o crescimento das Leptospiras sem interferir na mobilidade. O meio seletivo será distribuído em tubos plásticos de 50 mL, devidamente lacrados e identificados, sendo armazenados sob refrigeração (4°C). Antes do uso, será realizada a prova de esterilidade, incubando-se os tubos a 30°C por 24 a 48 horas para garantir a ausência de contaminantes. A viabilidade do meio será testada com a repicagem de cepas de Leptospiras previamente cultivadas no laboratório, seguindo os protocolos de rotina.
Processamento das Amostras:
Após a coleta, o material será transportado imediatamente ao laboratório em condições de refrigeração controlada, para garantir a preservação das amostras. No laboratório, dentro de uma cabine de fluxo laminar previamente esterilizada, as amostras serão manipuladas utilizando instrumentais cirúrgicos estéreis, como bisturis, tesouras e pinças, para garantir a assepsia. Fragmentos de aproximadamente 2-3 cm³ do tecido renal serão removidos assepticamente e transferidos diretamente para um tubo contendo meio de cultura líquido EMJH, já preparado e esterilizado. Os tubos serão incubados em uma estufa bacteriológica a 29°C, temperatura ideal para o crescimento de Leptospira spp., e monitorados semanalmente. Durante este período, serão realizadas avaliações tanto macro quanto microscópicas para verificar o crescimento bacteriano, utilizando microscopia de campo escuro. Posteriormente, as amostras de Leptospira serão enviadas para um laboratório de referência, onde será realizada a identificação do sorogrupo e sorovar por meio de técnicas como aglutinação microscópica (MAT) e PCR específica para sorovares.
PCR e Sequenciamento do DNA:
Todas as culturas positivas serão submetidas à análise por reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção de Leptospira. A extração do DNA será realizada utilizando kits comerciais adequados para extração de DNA bacteriano, que têm demonstrado alta eficiência na purificação de DNA de amostras de Leptospira. Os primers utilizados serão específicos para a amplificação de segmentos de genes conservados em espécies de Leptospira, seguindo protocolos amplamente descritos na literatura recente. As condições da reação de PCR incluirão ciclos de desnaturação, anelamento e extensão conforme recomendados pelos fabricantes dos kits e descritos por autores recentes, garantindo uma amplificação robusta do DNA leptospiral.
Indicadores, Metas e Resultados
Metas:
Confeccionar meios de cultura seletivos para o isolamento de Leptospiras.
Detectar DNA leptospiral na urina e rins de animais abatidos.
Obter isolados de Leptospiras de sorovares importantes para a leptospirose animal.
Classificar os novos isolados através do sequenciamento de DNA.
Indicadores de Progresso:
Inicialmente, todos os protocolos necessários para a execução do projeto serão elaborados, e os equipamentos e reagentes previstos, adquiridos. Após, os meios de cultura serão confeccionados e os primers, desenhados para a amplificação dos genes. Além disso, será realizada uma revisão bibliográfica criteriosa sobre o assunto e, neste momento, os reagentes e materiais necessários para a execução serão adquiridos. Posteriormente, serão iniciadas as coletas das amostras nos frigoríficos e o cultivo de Leptospiras. Todos os cultivos com crescimento serão expandidos em maior escala visando à extração de DNA e à aplicação das técnicas de PCR e sequenciamento. Durante as diferentes etapas do projeto, serão redigidos artigos científicos, dissertações e teses.
Resultados Esperados:
Espera-se realizar o isolamento de pelo menos uma cepa de Leptospira de qualquer espécie animal estudada e a classificação do(s) isolado(s) ao nível de espécie genômica, com o depósito das sequências obtidas no GenBank. Além disso, espera-se realizar o treinamento de alunos de graduação em veterinária ou cursos afins, e gerar pelo menos um artigo científico para publicação em periódico de circulação internacional. Também serão submetidos resumos em congressos nacionais e regionais.
Confeccionar meios de cultura seletivos para o isolamento de Leptospiras.
Detectar DNA leptospiral na urina e rins de animais abatidos.
Obter isolados de Leptospiras de sorovares importantes para a leptospirose animal.
Classificar os novos isolados através do sequenciamento de DNA.
Indicadores de Progresso:
Inicialmente, todos os protocolos necessários para a execução do projeto serão elaborados, e os equipamentos e reagentes previstos, adquiridos. Após, os meios de cultura serão confeccionados e os primers, desenhados para a amplificação dos genes. Além disso, será realizada uma revisão bibliográfica criteriosa sobre o assunto e, neste momento, os reagentes e materiais necessários para a execução serão adquiridos. Posteriormente, serão iniciadas as coletas das amostras nos frigoríficos e o cultivo de Leptospiras. Todos os cultivos com crescimento serão expandidos em maior escala visando à extração de DNA e à aplicação das técnicas de PCR e sequenciamento. Durante as diferentes etapas do projeto, serão redigidos artigos científicos, dissertações e teses.
Resultados Esperados:
Espera-se realizar o isolamento de pelo menos uma cepa de Leptospira de qualquer espécie animal estudada e a classificação do(s) isolado(s) ao nível de espécie genômica, com o depósito das sequências obtidas no GenBank. Além disso, espera-se realizar o treinamento de alunos de graduação em veterinária ou cursos afins, e gerar pelo menos um artigo científico para publicação em periódico de circulação internacional. Também serão submetidos resumos em congressos nacionais e regionais.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| EVERTON FAGONDE DA SILVA | 3 | ||
| KAROLINA SILVA SOARES | |||
| MARIA GABRIELA CUSTODIO KOBAYASHI |