Obtenção das lectinas
Produção das proteínas recombinantes
Para a expressão das proteínas recombinantes, os vetores pET28a contendo as diferentes
sequências serão utilizados para transformar E. coli BL21 (DE3) Star por eletroporação. A bactéria
será cultivada em meio Luria Bertani (LB) líquido contendo 100 µg.mL-1 de canamicina, a 200 rpm
de agitação, 37 °C, de 12 - 14 h. Posteriormente, 50 mL do cultivo será utilizado como pré-inóculo
em 450 mL de meio LB líquido, contendo antibiótico e a cultura será incubada sob agitação (37
°C, 200 rpm) até atingirem a densidade ótica a 600 nm (D.O.600nm) de 0,6 - 0,8. A expressão da
proteína recombinante será induzida com 0,5 M de isopropil β-D-tiogalactosídeo (IPTG) e
incubada durante 3-4 h nas mesmas condições anteriores. Ao final do cultivo, uma alíquota de 1
mL da amostra será coletada, centrifugada 10.000 × g por 1 min e o pellet utilizado para
confirmação da expressão da proteína recombinante através de SDS-PAGE 12%. O restante do
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cultivo será utilizado para a purificação da proteína recombinante e avaliação da solubilidade da
proteína.
Purificação das proteínas
Para a purificação das proteínas, após a expressão dos diferentes vetores, o cultivo será
centrifugado a 7.000 × g por 10 min a 4 °C, o meio de cultura descartado, sendo o precipitado
solubilizado em tampão de lise (200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, 5 mM de imidazol, 100
μg/mL Lisozima, pH 8,0), sonicado (6 ciclos de 30 s, 60 kHz) e centrifugado (10.000 × g por 30
min a 4 °C). O sobrenadante resultante, contendo a fração solúvel da proteína recombinante, será
armazenado a -20 °C até a purificação. O pellet será solubilizado em tampão de lavagem (200 mM
de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl e 30 mM de imidazol, pH 8,0) acrescido de 0,2% N-Lauroylsarcosine
(NLS) e incubado por 16 h a 4 °C. Após nova centrifugação, o sobrenadante será armazenado a -
20°C e o precipitado solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 8M de uréia. Após as etapas
de solubilização, as amostras serão submetidas à análise por SDS-PAGE 12% para determinação
da fração contendo a proteína recombinante.
As frações da proteína (solúvel e insolúvel) serão submetidas à purificação através de
cromatografia de afinidade utilizando coluna de Ni2+ Sepharose HisTrap. A proteína será eluída
da coluna com gradiente de imidazol. As frações contendo a proteína eluída serão identificadas por
SDS-PAGE 12% e dialisadas de forma lenta, utilizando membrana de celulose (25 mm x 16 mm)
para diálise (Sigma, EUA) e tampão fosfato salino (PBS) 1X, pH 7,4, em sistema de fluxo contínuo
(24-48 h a 4°C). A concentração das proteínas purificadas será determinada usando BCA Protein
Assay Kit (Pierce, USA). A proteína recombinante também será analisada por Western blotting
(WB) utilizando anticorpo monoclonal (mAb) anti-HIS6x conjugado com peroxidase (Sigma,
EUA) na diluição de 1:10.000.
Produção dos Biossensores
Fabricação de eletrodos
Os eletrodos LIG foram produzidos pelo processo de escrita direta a laser utilizando uma
máquina de gravação a laser CO 2 (Visutec Router Laser VS3020) em folhas PI (Kapton, Dupont)
previamente fixadas em substratos transparentes de poliéster. Os biossensores foram fabricados em
uma configuração de três eletrodos em condições ambientais. O eletrodo de trabalho foi gravado
com área ativa de 7,07 mm 2, enquanto os eletrodos contador e de referência foram obtidos com
áreas ativas de 15,60 mm 2 e 6 mm 2, respectivamente. A potência do laser de CO 2, a varredura
e a distância entre o feixe de laser e os substratos de PI foram fixadas em 3,9 W, 100 mm·s −1 e
51 mm, respectivamente. Fita de poliimida Kapton foi aplicada para isolar os eletrodos do
eletrólito. Após o processo DLW, o eletrodo de referência foi coberto com uma fina camada de
tinta Ag/AgCl (ALS Co., Tóquio, Japão).
Funcionalização dos biossensores com as lectinas
A biofuncionalização do eletrodo de trabalho será realizada como descrito em Oliveira e
colaboradores (2022), para a ligação da lectina ao sensor eletroquímico. Neste procedimento,
primeiramente, 5,0 µL de uma solução contendo 5 mmol de NHidroxisuccinimida (NHS) (SigmaAldrich, St. Louis, EUA) e 20 mmol de 1etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) dissolvida em um 1× solução salina tamponada com fosfato (1×
PBS, 0,1 mol·L −1 em pH 7,4) será depositado na superfície do eletrodo e deixado em repouso por
1 horas a uma temperatura de 4 ◦C. Depois, serão adicionados a molécula de lectina. As lectinas
serão dissolvidas em uma solução tampão (vai depender da solubilidade da lectina ao tampão) e
depositadas no eletrodo, permanecendo por 12 h para secagem a uma temperatura de 4 ◦C. Por fim,
o eletrodo será lavado com a solução tampão para remover espécies bioativas que não reagiram e
5,0 µL de albumina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) na concentração de 100
µg·mL−1 em PBS será depositada no eletrodo para bloquear grupos não funcionalizados com as
lectinas. Após 4 horas a uma temperatura de 4 ◦C, o eletrodo foi lavado 5x com PBS.
Cultivo das células tumorais
Para a detecção das células tumorais, as linhagens de celulares tumorais e não tumorais
serão inicialmente cultivadas a 37°C numa atmosfera úmida contendo 5% de CO2 em Meio Eagle
Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). A 50%
de confluência, as células serão contadas através da contagem da câmara Neubauer com o azul de
tyrpan. Tipicamente, as células colhidas por centrifugação a 150x g durante 5 min. Após remoção
do sobrenadante, as células serão dispersas em volume apropriado de PBS (50 mM, pH 7,3)
necessário para concentrações celulares precisas. A captura de diferentes concentrações de células
na superfície modificada do biossensor contendo a lectina será conseguida pela incubação dos
eletrodos em soluções de diferentes concentrações celulares (1x104 até 6x104
) por diferentes
tempos, variando de 15 min a 1 h, a temperatura ambiente. Como controle negativo usaremos
linhagens de células normais e funcionalização dos eletrodos com proteínas controle, sem
capacidade de ligação a carboidratos, com Soro Albumina Bovino (BSA), por exemplo.
Calibração e Ensaio de Detecção
As primeiras análises eletroquímicas serão realizadas para a calibração, seguindo as
principais modificações relatadas na bibliografia recente (RAHMAN et al., 2024; YAKOH et al.,
2021; OLIVEIRA et al., 2020). Os ensaios eletroquímicos utilizarão voltametria de pulso
diferencial (DPV) na faixa de potencial entre -0,2 e 0,3 V, com taxa de varredura de 6 mV·s-1 e
pulso de 0,19 V, com eletrólito 0,05 M de hexacianoferrato de potássio (III/II) ou [Fe(CN)6]3-/4-,
e 0,01 M de solução salina fosfato-tampão (PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RAHMAN et
al., 2024). Os sensores modificados terão dois tipos de calibração:
O primeiro abordará a adição de nanopartículas de platina por eletrodeposição, aplicando um
potencial de -1,4 V e variando o tempo de deposição em 50, 100, 200, 300 e 500 s, de acordo com
o depósito de patente BR 10 2021 009120.
O segundo parâmetro será a variação da quantidade de lectina ancorada no sensor, variando
de 1, 3, 6, 10 e 20 µg.ml-1 na superfície do sensor. A concentração de lectina no sensor pode variar
dependendo do tipo de lectina utilizada, serão utilizadas as lectinas H84T, BVL, da matriz do
sensor e das condições específicas de detecção.
As primeiras etapas serão realizadas na ausência e presença de Manose (10 µM). Será
utilizada a manose pois ela está presente em grande quantidade nos marcadores diagnósticos de
câncer nas células tumorais O sensor que obtiver melhor performance passará para os testes de
detecção de células cancerígenas isoladas, obtenção de uma curva analítica e, por fim, detecção de
amostras de soro e urina de amostras reais.
Análise estatística
Para a análise estatística serão utilizados o software e o Origin 9. todos os testes serão
realizados em triplicata para realização das medias e desvio padrão dos dados obtidos