Portal InstitucionalUFPEL

O câncer é uma doença que atinge o mundo todo, afetando milhões de pessoas todos os anos;
a elaboração de um método de diagnóstico rápido é essencial para se iniciar um tratamento precoce
e assim aumentar a taxa de sobrevivência dos pacientes. Este projeto consiste na elaboração de um
biossensor para detecção de células tumorais através de lectinas, proteínas capazes de identificar
aberrações na glicosilação de células tumorais. Este biossensor deve ser capaz de detectar de forma
rápida, sensível e eficaz e presença de células tumorais em amostras de urina por exemplo. O
diagnóstico de câncer de bexiga e outros tipos de neoplasias do trato urinário normalmente são
invasivos e causam profundo desconforto aos pacientes. Desenvolver um sistema de diagnóstico
rápido e não invasivo tem sido um dos campos de pesquisa na área que mais cresce, devido a sua
elevada relevância. Cabe lembrar que o carcinoma urotelial é o nono tipo de câncer que mais ocorre
no mundo, e é diagnosticado como uma doença superficial, porém o câncer de bexiga tem alta taxa
de reincidência e de progressão da doença, além de ser a mais comum doença maligna do trato
urinário, com aproximadamente 11.370 novos casos de câncer de bexiga em 2022 no Brasil.

Obtenção das lectinas
Produção das proteínas recombinantes
Para a expressão das proteínas recombinantes, os vetores pET28a contendo as diferentes
sequências serão utilizados para transformar E. coli BL21 (DE3) Star por eletroporação. A bactéria
será cultivada em meio Luria Bertani (LB) líquido contendo 100 µg.mL-1 de canamicina, a 200 rpm
de agitação, 37 °C, de 12 - 14 h. Posteriormente, 50 mL do cultivo será utilizado como pré-inóculo
em 450 mL de meio LB líquido, contendo antibiótico e a cultura será incubada sob agitação (37
°C, 200 rpm) até atingirem a densidade ótica a 600 nm (D.O.600nm) de 0,6 - 0,8. A expressão da
proteína recombinante será induzida com 0,5 M de isopropil β-D-tiogalactosídeo (IPTG) e
incubada durante 3-4 h nas mesmas condições anteriores. Ao final do cultivo, uma alíquota de 1
mL da amostra será coletada, centrifugada 10.000 × g por 1 min e o pellet utilizado para
confirmação da expressão da proteína recombinante através de SDS-PAGE 12%. O restante do
14
cultivo será utilizado para a purificação da proteína recombinante e avaliação da solubilidade da
proteína.
Purificação das proteínas
Para a purificação das proteínas, após a expressão dos diferentes vetores, o cultivo será
centrifugado a 7.000 × g por 10 min a 4 °C, o meio de cultura descartado, sendo o precipitado
solubilizado em tampão de lise (200 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, 5 mM de imidazol, 100
μg/mL Lisozima, pH 8,0), sonicado (6 ciclos de 30 s, 60 kHz) e centrifugado (10.000 × g por 30
min a 4 °C). O sobrenadante resultante, contendo a fração solúvel da proteína recombinante, será
armazenado a -20 °C até a purificação. O pellet será solubilizado em tampão de lavagem (200 mM
de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl e 30 mM de imidazol, pH 8,0) acrescido de 0,2% N-Lauroylsarcosine
(NLS) e incubado por 16 h a 4 °C. Após nova centrifugação, o sobrenadante será armazenado a -
20°C e o precipitado solubilizado com tampão de lavagem acrescido de 8M de uréia. Após as etapas
de solubilização, as amostras serão submetidas à análise por SDS-PAGE 12% para determinação
da fração contendo a proteína recombinante.
As frações da proteína (solúvel e insolúvel) serão submetidas à purificação através de
cromatografia de afinidade utilizando coluna de Ni2+ Sepharose HisTrap. A proteína será eluída
da coluna com gradiente de imidazol. As frações contendo a proteína eluída serão identificadas por
SDS-PAGE 12% e dialisadas de forma lenta, utilizando membrana de celulose (25 mm x 16 mm)
para diálise (Sigma, EUA) e tampão fosfato salino (PBS) 1X, pH 7,4, em sistema de fluxo contínuo
(24-48 h a 4°C). A concentração das proteínas purificadas será determinada usando BCA Protein
Assay Kit (Pierce, USA). A proteína recombinante também será analisada por Western blotting
(WB) utilizando anticorpo monoclonal (mAb) anti-HIS6x conjugado com peroxidase (Sigma,
EUA) na diluição de 1:10.000.
Produção dos Biossensores
Fabricação de eletrodos
Os eletrodos LIG foram produzidos pelo processo de escrita direta a laser utilizando uma
máquina de gravação a laser CO 2 (Visutec Router Laser VS3020) em folhas PI (Kapton, Dupont)
previamente fixadas em substratos transparentes de poliéster. Os biossensores foram fabricados em
uma configuração de três eletrodos em condições ambientais. O eletrodo de trabalho foi gravado
com área ativa de 7,07 mm 2, enquanto os eletrodos contador e de referência foram obtidos com
áreas ativas de 15,60 mm 2 e 6 mm 2, respectivamente. A potência do laser de CO 2, a varredura
e a distância entre o feixe de laser e os substratos de PI foram fixadas em 3,9 W, 100 mm·s −1 e
51 mm, respectivamente. Fita de poliimida Kapton foi aplicada para isolar os eletrodos do
eletrólito. Após o processo DLW, o eletrodo de referência foi coberto com uma fina camada de
tinta Ag/AgCl (ALS Co., Tóquio, Japão).
Funcionalização dos biossensores com as lectinas
A biofuncionalização do eletrodo de trabalho será realizada como descrito em Oliveira e
colaboradores (2022), para a ligação da lectina ao sensor eletroquímico. Neste procedimento,
primeiramente, 5,0 µL de uma solução contendo 5 mmol de NHidroxisuccinimida (NHS) (SigmaAldrich, St. Louis, EUA) e 20 mmol de 1etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) dissolvida em um 1× solução salina tamponada com fosfato (1×
PBS, 0,1 mol·L −1 em pH 7,4) será depositado na superfície do eletrodo e deixado em repouso por
1 horas a uma temperatura de 4 ◦C. Depois, serão adicionados a molécula de lectina. As lectinas
serão dissolvidas em uma solução tampão (vai depender da solubilidade da lectina ao tampão) e
depositadas no eletrodo, permanecendo por 12 h para secagem a uma temperatura de 4 ◦C. Por fim,
o eletrodo será lavado com a solução tampão para remover espécies bioativas que não reagiram e
5,0 µL de albumina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) na concentração de 100
µg·mL−1 em PBS será depositada no eletrodo para bloquear grupos não funcionalizados com as
lectinas. Após 4 horas a uma temperatura de 4 ◦C, o eletrodo foi lavado 5x com PBS.
Cultivo das células tumorais
Para a detecção das células tumorais, as linhagens de celulares tumorais e não tumorais
serão inicialmente cultivadas a 37°C numa atmosfera úmida contendo 5% de CO2 em Meio Eagle
Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). A 50%
de confluência, as células serão contadas através da contagem da câmara Neubauer com o azul de
tyrpan. Tipicamente, as células colhidas por centrifugação a 150x g durante 5 min. Após remoção
do sobrenadante, as células serão dispersas em volume apropriado de PBS (50 mM, pH 7,3)
necessário para concentrações celulares precisas. A captura de diferentes concentrações de células
na superfície modificada do biossensor contendo a lectina será conseguida pela incubação dos
eletrodos em soluções de diferentes concentrações celulares (1x104 até 6x104
) por diferentes
tempos, variando de 15 min a 1 h, a temperatura ambiente. Como controle negativo usaremos
linhagens de células normais e funcionalização dos eletrodos com proteínas controle, sem
capacidade de ligação a carboidratos, com Soro Albumina Bovino (BSA), por exemplo.
Calibração e Ensaio de Detecção
As primeiras análises eletroquímicas serão realizadas para a calibração, seguindo as
principais modificações relatadas na bibliografia recente (RAHMAN et al., 2024; YAKOH et al.,
2021; OLIVEIRA et al., 2020). Os ensaios eletroquímicos utilizarão voltametria de pulso
diferencial (DPV) na faixa de potencial entre -0,2 e 0,3 V, com taxa de varredura de 6 mV·s-1 e
pulso de 0,19 V, com eletrólito 0,05 M de hexacianoferrato de potássio (III/II) ou [Fe(CN)6]3-/4-,
e 0,01 M de solução salina fosfato-tampão (PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RAHMAN et
al., 2024). Os sensores modificados terão dois tipos de calibração:
O primeiro abordará a adição de nanopartículas de platina por eletrodeposição, aplicando um
potencial de -1,4 V e variando o tempo de deposição em 50, 100, 200, 300 e 500 s, de acordo com
o depósito de patente BR 10 2021 009120.
O segundo parâmetro será a variação da quantidade de lectina ancorada no sensor, variando
de 1, 3, 6, 10 e 20 µg.ml-1 na superfície do sensor. A concentração de lectina no sensor pode variar
dependendo do tipo de lectina utilizada, serão utilizadas as lectinas H84T, BVL, da matriz do
sensor e das condições específicas de detecção.
As primeiras etapas serão realizadas na ausência e presença de Manose (10 µM). Será
utilizada a manose pois ela está presente em grande quantidade nos marcadores diagnósticos de
câncer nas células tumorais O sensor que obtiver melhor performance passará para os testes de
detecção de células cancerígenas isoladas, obtenção de uma curva analítica e, por fim, detecção de
amostras de soro e urina de amostras reais.
Análise estatística
Para a análise estatística serão utilizados o software e o Origin 9. todos os testes serão
realizados em triplicata para realização das medias e desvio padrão dos dados obtidos

Obtenção de um Biossensor funcionalizado com lectinas para detecção de células tumorais.
Artigo científico publicado em revista internacional.