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O selênio é um micronutriente que possui importantes funções antioxidantes em pequenas concentrações, pois é parte essencial de importantes enzimas antioxidantes (KIEŁCZYKOWSKA et al., 2018). O selênio têm sido alvo de muitas pesquisas e além da atividade antioxidante acredita-se ter um efeito benéfico no tratamento de transtornos como a depressão e ansiedade (SAMAD et al., 2021). Nesse sentido, diferentes autores relataram que compostos orgânicos de selênio apresentam ação antioxidante em protocolos in vitro e in vivo (YADAV et al., 2023; BOCCHINI et al., 2021; GARCIA et. al., 2024). Além disso, o grupo indol é importante para atividade antioxidante (ZHANG et. al., 2021; POLITI et al., 1996; PAREDES et al., 2008) por ser uma das mais abundantes estruturas heterocíclicas com ação farmacológica na natureza, é encontrada, por exemplo, na serotonina (CASARIL et al., 2017).
Nesse sentido, o presente projeto tem como objetivo investigar o efeito antioxidante do disseleneto de bis(3-indolina)(DBI) na peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas, na geração de espécies reativas em tecido cerebral de camundongos. Visto que o composto já demonstrou uma potente ação antioxidante no DPPH (atividade scavenger do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila), ABTS (captura do radical 2,2´ azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)) e FRAP (potencial de redução do íon férrico) em baixas concentrações. Além disso, também demonstrou atividade mimética a enzima glutationa S-transferase em baixas concentrações.
Espera-se também avaliar o potencial de inibição da enzima monoamina oxidase (MAO) nas duas isoformas, MAO-A e MAO-B. Essa inibição é importante para tratamentos como o da depressão, onde a teoria mais aceita sobre sua fisiopatologia é a hipótese monoaminérgica, que sugere que uma deficiência de monoaminas na fenda sináptica pode causar transtornos depressivos. Os inibidores da monoamina oxidase (IMAO) visam inibir a enzima MAO, prolongando o efeito das monoaminas na fenda sináptica e atenuando os sintomas depressivos (SHULMAN et al., 2013).
Além disso, avaliar a toxicidade oral aguda em camundongos Swiss fêmeas, visto que os testes de toxicidade aguda são essenciais em estudos biológicos para avaliar substâncias com potencial de toxicidade desconhecida. Esse teste visa avaliar os efeitos adversos após a administração de dose única em um curto período. Essa informação é crucial para identificar os riscos à saúde de uma exposição breve a uma substância, auxiliando na determinação de doses terapêuticas em modelos animais de doenças humanas (GONÇALVES, 2011; COSTA, 2013).

Teste In Vitro
A viabilidade celular frente ao composto DBI será testada em células VERO e L929. Nesta técnica não será usado tecido animal.
Posteriormente, será realizada uma triagem de ação antioxidante com tecido animal, para isso o composto será testado em diferentes concentrações variando de 0,5-500μM. Estes ensaios contarão com um grupo controle, um grupo veículo (DMSO), um grupo de indução (nitroprussiato de sódio, NPS), um grupo referente ao controle positivo da técnica (trolox, 100 μM) e as diferentes concentrações do composto. Os experimentos serão realizados em duplicata e repetidos 5 vezes (N=5) e sendo assim utilizados 5 animais em cada experimento, como são 4 diferentes experimentos totaliza-se 20 animais para testes in vitro.
Ensaio de carbonilação de proteínas
Este experimento in vitro foi adaptado de Levine et al. (1990). O objetivo é induzir danos oxidativos nas proteínas do tecido a ser analisado e determinar se o composto em estudo pode reverter esses danos. Os homogeneizados cerebrais serão preparados com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4, na proporção de 1:10 (peso/volume), e posteriormente diluídos a 1:8. Em diferentes tubos de ensaio, adicionamos 10 μl do composto para ser testado nas concentrações de 0,5 a 500 μM. Em seguida, adicionamos 940 μl do homogeneizado diluído a todos os tubos e, posteriormente, 50 μl de NPS como indutor de carbonilação de proteínas. Os tubos serão incubados a 37°C por 2 horas. Após esse período, adicionamos 200 μl de HCl 2M aos tubos de controle e 200 μl da solução DNPH aos tubos testados. Incubamos por 1 h no escuro à temperatura ambiente, mexendo a cada 15 min para facilitar a reação. Em seguida, adicionamos um volume de 500 μl de tampão de desnaturação, 1,5 ml de etanol e 1,5 ml de hexano a todos os tubos. Agitamos por 40 segundos com auxílio de vórtex. Os tubos serão então centrifugados a 2500 rpm por 15 min e o sobrenadante será cuidadosamente removido. O pellet formado no tubo será lavado duas vezes com 1 ml de solução de etanol/acetato de etila (1:1). Após um período de secagem de 2 minutos, o pellet será ressuspenso com 1 ml de tampão desnaturante e lido em um espectrofotômetro a 370 nm. Os resultados serão expressos como nmol de carbonila por mg de proteína.
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
As espécies reativas de oxigênio reagem com os lipídios da membrana, causando lipoperoxidação e a formação de malondialdeído (MDA). Essa substância reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) sob aquecimento, resultando na formação de um composto de coloração rosada, cuja intensidade está relacionada à quantidade de malondialdeído formado. A formação de MDA é analisada por meio de um espectrofotômetro. Neste experimento o composto em estudo será dissolvido em DMSO e utilizado em diferentes concentrações (0,5 a 500 μM) em diferentes tubos para a análise de TBARS, seguindo o protocolo descrito por Ohkawa et al. (1979). Utiliza-se NPS (50 mM) como indutor de peroxidação lipídica nos homogeneizados cerebrais de camundongos, exceto no grupo controle. Com o auxílio de homogeneizador de Potter, o tecido será homogeneizado em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, na proporção de 1:10 (p/v). Em seguida, centrifugado a 2.500 rpm por 10 minutos e o sobrenadante (100 μL) será misturado com solução preparada com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 (30 μL) e NPS 0,3 mM (50 μL). Adicionalmente, 10 μL de DMSO serão adicionados ao grupo veículo e, para as concentrações testadas, 10 μL do composto diluído para cada concentração serão adicionados. Água Milli-Q será adicionada para completar 300 μL o volume final. A amostra será então incubada a 37 °C por 1 h em banho-maria. Em seguida, serão adicionados TBA 0,8% (500 μL), tampão ácido acético pH 3,4 (500 μL) e
dodecil sulfato de sódio 8,1% (SDS) (200 μL). Finalmente, após incubação a 95 °C por 1 h em banho-maria, a absorbância será medida usando cubeta e espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados serão expressos em nmol TBARS/g de tecido.
Ensaio de detecção de espécies reativas (ER)
A quantificação dos níveis de espécies reativas será determinada pela oxidação de dicloro-diidro-fluoresceína diacetato (DCHF-DA) para 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente através de espectrofluorimetría convencional. Para isto se prepara a amostra com o auxílio de homogeneizador de Potter, o tecido cerebral será homogeneizado em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, na proporção de 1:10 (p/v). Em seguida, será centrifugado a 2.500 rpm por 10 minutos e se obtém o sobrenadante. Então é pipetado em todos os tudos tris HCl (2940 μL no controle e 2910 μL no induzido e nas diferentes concentrações do composto), 30 μL de azida (exceto o controle), 10 μL do composto diluído ou o seu veículo e 50 μL de amostra. Por fim, se acrescenta 20 μL de difluoresceína em todos os tubos. Deve-se deixar as amostras no escuro por 1 hora e a intensidade da fluorescência de DCF será registrada a 525 nm e excitação em 488 nm em espectrofotômetro. Os valores serão expressos em unidade (U) de fluorescência (LOETCHUTINAT et al., 2005).
Atividade da monoamina oxidase cerebral (MAO)
Para avaliar a atividade da monoamina oxidase (MAO), será realizada uma análise de uma fração cerebral rica em mitocôndrias, seguindo o protocolo descrito por Soto‐Otero et al. (2001). O cérebro é homogeneizado em um tampão na proporção 1:4(peso/volume) e submetido a centrifugação (900g). Retira-se 1 mL do sobrenadante e centrifuga novamente (12.500g), e o pellet formado é ressuspenso com tampão de homogeneização. Uma nova fração deve ser centrifugada (12.500g) e ressuspenso no tampão de ensaio, formando uma fração rica em mitocôndrias a serem usadas no experimento. Esta fração cerebral é armazenada a -80°C porque o congelamento da amostra favorece a liberação da atividade enzimática nos sobrenadantes. A oxidação de um substrato (quinuramina) pelos resultados das isoformas MAO-A e MAO-B na formação de 4-hidroxiquinolina, um produto fluorescente como descrito por Krajl (1965) e Matsumoto e colaboradores (1984). A inibição enzimática é determinada pela redução da fluorescência. No dia do experimento, as amostras ricas em mitocôndrias (100μl) são incubadas a 37°C por 5 min com pargilina, um Inibidor seletivo da MAO-B, ou clorgilina, um inibidor seletivo da MAO-A. Após esse processo é adicionado o composto DBI que foi previamente diluído em DMSO e utilizado nas concentrações de 0,5 a 500μM e ocorrerá uma incubação por 10 minutos a 37°C. O veículo DMSO é adicionado ao tubo de controle. Depois desta incubação, o substrato quinuramina é adicionado (90μM para MAO-A e 60μM para ensaio MAO-B) e incubados por 30 min a 37°C. A reação é interrompida com solução tricloroacética a 10% e subsequentemente centrifugado por 5 min a 16.000g a 4°C. Retira-se 800 μL do sobrenadante e acrescenta-se 1 mL de hidróxido de sódio 1M (NaOH), após o qual as amostras serão lidas em um fluorímetro com o parâmetros de excitação correspondentes de 315 nm e emissão de 380 nm. Os resultados são calculados como a porcentagem de Inibição da MAO por regra direta de três considerando a leitura do tubo sem o inibidor como 100% de atividade enzimática. Os resultados são expressos como nmol de 4‐OH quinolina/mg de proteína.
Teste ex vivo
Teste de toxicidade oral aguda
Para avaliar a possível toxicidade do composto,camundongos fêmeas receberão uma única dose
oral do composto DBI na dose de 300mg/kg ou veículo conforme indicado pelas diretrizes da OECD (2001). Serão utilizadas ao total 12 fêmeas com jejum de 3-4h antes da administração e com variação de no máximo 20% do peso corporal, conforme preconizado pela OECD. Os animais serão observados a cada 30 min durante as primeiras 24 h e depois diariamente por 14 dias (OECD) para determinar o potencial letal do composto.
Serão avaliados os parâmetros: mortalidade, alterações comportamentais (diarréia, piloereção, aparecimento de convulsão), consumo de comida, consumo de água, peso corporal.
Após o teste de toxicidade recomendado pela OECD, os camundongos serão anestesiados para o procedimento de punção cardíaca e o sangue será coletado em tubos contendo heparina. O plasma será obtido após centrifugação e usado para ensaios bioquímicos através de kits comerciais. As atividades da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no plasma serão usadas como
indicadores de função hepática (REITMAN; FRANKEL, 1957). A função renal será avaliada pelos níveis plasmáticos de ureia (MACKAY; MACKAY, 1927). Amostras hemolisadas serão descartadas. Além disso, serão analisados o fígado e rim removidos por dissecação.

Espera-se que este estudo revele o potencial antioxidante e neuroprotetor do DBI em um modelo animal, fornecendo evidências importantes para o desenvolvimento de novas terapias para doenças neurodegenerativas e psiquiátricas. Caso o DBI se mostre eficaz e seguro, ele poderá ser considerado um candidato promissor para futuros estudos clínicos em humanos. Além disso esse estudo contribuirá na formação de alunos de iniciação científica e pós-graduandos.