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Nos últimos anos, a agricultura brasileira vem se modernizando e elevando a produção de algumas culturas, principalmente de grãos. O Brasil é o maior produtor em grãos do mundo (CONAB, 2022) sendo os principais fatores para esse destaque os investimentos em tecnologias de manejo e aumento de área cultivada. A soja (Glycine max L.) se destaca como o principal grão produzido no país, com grande contribuição na economia nacional.
A soja é uma planta herbácea de ciclo anual que mede de 80 a 150 cm de altura, com folhas alternadas trifolioladas e frutos em forma de vagem contendo sementes de formato globoso (MULLER, 1981). A fenologia da soja compreende dois estádios, o estádio vegetativo, o qual representa a fase de estabelecimento e desenvolvimento das plantas e o estádio reprodutivo, estendendo-se do florescimento até a maturação das vagens (NEUMAIER et al., 2000).
No cenário do agronegócio mundial, a soja tem um relevante peso na balança comercial, e seu crescimento está diretamente associado às novas práticas agrícolas, aos avanços científicos e disponibilidade de novas tecnologias que auxiliam no desenvolvimento do setor produtivo.
O estabelecimento da soja como cultura viável deve-se ao desempenho de cultivares a partir de cruzamentos e seleções de variedades adequadas e seu potencial de rendimento máximo é expresso em sua plenitude sob condições ótimas (OLIVEIRA, 2017). Vale ressaltar que, a produção agrícola é um desafio diário, visto que sofre a influência de uma série de variáveis que o produtor não tem como controlar, as quais podem comprometer todos os esforços do processo produtivo ou contribuir com ganhos e satisfação no final de cada safra.
A qualidade das sementes de soja é de extrema importância para obtenção de alta produtividade. Portanto, os fatores que comprometem a qualidade da semente devem ser observados e entre esses fatores estão elevados índices de ataque de insetos-praga. Em ambientes de lavouras, a cultura encontra-se exposta ao ataque de diferentes espécies, entre elas os lepidópteros, os quais acabam causando perdas consideráveis que refletem na produção de sementes de soja (HOFFMANN-CAMPO et al., 2000; NEUMAIER et al., 2000).
É importante salientar que, a alimentação dos lepidópteros, durante a fase imatura, reduz a capacidade fotossintética das plantas comprometendo, o enchimento das vagens na fase reprodutiva e a produção de grãos (GAZZONI; YORINIORI, 1995). A lagarta-falsa-medideira, Chrysodeixis includens (Walker, 1857), é um lepidóptero capaz de consumir 60 a 200 cm2 de limbo foliar durante seu ciclo (BUENO et al., 2011). Sua presença em várias regiões produtivas, se intensificou nas últimas duas décadas, devido as mudanças climáticas, expansão da época e área de plantio, conformação e manejo do cultivo da soja, desequilíbrio ecológico devido ao uso indiscriminado de fungicidas e inseticidas e aos aspectos comportamentais da espécie (BUENO et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2010) sendo assim, considerada o principal lepidóptero-praga da sojicultura (AVILA; GRIGOLLI, 2014; BUENO et al., 2007; BUENO et al., 2017).
A intervenção por meio do uso de inseticidas sintéticos ainda é a forma de regulação mais empregada no controle. Portanto, a utilização incorreta desses produtos causa contaminação ambiental, mortalidade de inimigos naturais, evolução da resistência de insetos e intoxicação aguda de consumidores e trabalhadores rurais (ALMEIDA; CARNEIRO; VILELA, 2009; BUENO et al., 2012).
A resistência de plantas surge nesse contexto, como uma importante ferramenta no manejo de insetos-pragas reduzindo a suscetibilidade das plantas às injúrias, influenciadas pela presença de compostos provenientes dos metabólitos secundários, além de ser compatível com os demais métodos culturais de controle (BOIÇA JÚNIOR et al., 2013; HOFFMANN-CAMPO et al., 2000; MOURA, 2015; SMITH, 2005; WALKER et al., 2000).
A utilização de genótipos resistentes é considerado uma ferramenta valiosa no conjunto de estratégias do Manejo Integrado de Pragas (MIP). Assim sendo, a resistência de plantas a insetos é um método alternativo ao controle químico e apresenta diversas vantagens (BALDIN et al., 2019). Sendo assim, o MIP, deve ser visto como a principal ferramenta e não uma possibilidade (PAPA, 2010). A redução de populações de insetos-praga, a preservação das populações de inimigos naturais, o incremento da diversidade no agroecossistema, a preservação e a redução da sustentabilidade das plantas às pragas são as principais estratégias do MIP na soja (CATCHOT, 2006).
Os mecanismos de resistência são geralmente subdivididos em pré-formados (constitutivos) e pós-formados (induzidos). Os fatores de resistência pré-formados encontram-se presentes nas plantas antes da interação com o inseto, e estão ligados à fatores estruturais e bioquímicos das plantas, enquanto que, os pós-formados, são produzidos e ativados em resposta ao contato, os quais desencadeiam reações de defesa (SILVA; PANIZZI, 2019).
Os mecanismos constitutivos das plantas demandam para o inseto, um custo adaptativo, visualizado através de alterações nos parâmetros biológicos e comportamentais do inseto. Fatores químicos defensivos em plantas podem causar efeitos tóxicos aos insetos que delas se alimentam (DUFFEY, 1980). A resistência das plantas de soja afetando aspectos biológicos como, peso, tamanho, período de desenvolvimento e razão sexual de C. includens são bem estudadas e conhecidas (BEACH; TOOD, 1988; LOURENÇÃO et al., 2000; PORTILLO; PITRE, 1992; SCHILCK-SOUZA, 2013; SMITH; GILMAN, 1981; TURNIPSEED; SULLIVAN, 1976; WILLE et al., 2017).
Nesse contexto, conhecer os parâmetros biológicos de um inseto é, dentre outros, essencial no desenvolvimento de estratégias para seu manejo eficiente. A criação de insetos em condições de laboratório permite o alcance de avanços significativos para o manejo de pragas nos sistemas agrícolas. Para isso, diversos fatores devem ser levados em consideração na manutenção de insetos, tais como: população inicial, tipo de alimento fornecido, aspectos nutricionais, recipientes de criação, temperatura, umidade, fotoperíodo, controle de qualidade, assepsia e outras necessidades que o inseto alvo pode apresentar (BOTELHO et al., 2019).
É importante destacar que, as plantas produzem uma grande diversidade de produtos químicos que podem ser classificados como metabólitos primários e secundários. Os metabólitos primários são aqueles compostos que todas as plantas produzem e que estão diretamente envolvidos no crescimento e desenvolvimento. Neles estão incluídos os açúcares, aminoácidos, ácidos graxos, lipídeos e nucleotídeos, assim como moléculas maiores, que são sintetizadas a partir deles, como proteínas, polissacarídeos, membranas, DNA e RNA (GARCÍA ; CARRIL, 2009).
Já os metabólitos secundários (ou metabólitos especializados), ao contrário dos primários, são altamente específicos e desempenham um papel importante na evolução dos vegetais. Geralmente, pertencem a uma das três principais classes de moléculas: terpenos, compostos fenólicos e nitrogenados (VIZZOTTO et al., 2010). Esses compostos geralmente estão relacionados com a proteção dos vegetais a estresses bióticos e abióticos além de serem comercialmente utilizados pelas indústrias biofarmacêutica, de corantes e aromas (RASKIN et al., 2002).
Os tricomas (pêlos) são apêndices epidérmicos que se projetam na superfície epidérmica, ocorrendo em todos os órgãos vegetais e possuem formas e funções variadas (THEOBALD et al., 1979, ALQUINE et al., 2006). Esses apêndices funcionam como uma barreira mecânica que protege o órgão contra a perda de água, excesso de radiação e herbivoria. Os tricomas podem armazenar metabólitos secundários e produzir substâncias específicas, como mucilagem, óleos, etc, sendo, neste caso, denominados secretores ou glandulares. Esses metabólitos, ficam armazenados em uma bolsa formada entre a parede celular e a cutícula, nas quais, mediante contato, rebentam e liberam seus conteúdos, e o cheiro forte e o sabor amargo desses compostos repelem os insetos herbívoros (TAIZ; ZEIGER, 2009).
A distribuição dos tricomas e dos estômatos podem influenciar a maneira como os corpos de oclusão da lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) se depositam e se fixam sobre a superfície foliar (SMALL et al., 1986) favorecendo ou não sua permanência na planta.
As cultivares de soja BRS 6203 RR, BRS 391, Tec Irga 6070 RR, BMX Icone Ipro, BMX Valente RR, PELBR 10-6000 e PELBR 10-6049 possuem folhas anfiestomáticas, com estômatos paracíticos e presença de tricomas filiformes unisseriados e tricomas glandulares unisseriados multicelulares claviformes. Os genótipos de soja com maior densidade de tricomas são mais preferidos para a oviposição, enquanto que para o consumo são menos preferidos os genótipos com tricomas mais densos (GOBBI et al., 2023).
A oviposição de C. includens em genótipos de soja em três níveis de pubescência, glabro, normal e denso, apresentou maior oviposição em folhas com maior densidade de tricomas (LAMBERT et al., 1992). Os resultados de SCHLICK-SOUZA et al. (2018) mostraram antixenose para oviposição, no entanto, não foram encontradas correlações entre densidade de tricomas e oviposição, para C. includens em genótipos de soja.
Ao considerar o potencial de dano que as espécies de lagartas desfolhadoras como a lagarta-falsa-medideira possuem, torna-se fundamental ampliar os estudos relacionados com a distribuição espacial, densidade de tricomas e os principais metabólitos secundários que constituem os tricomas, o que é relevante para a obtenção de cultivares de alto rendimento, adaptadas ao ambiente e resistentes ao ataque de insetos, contribuíndo para a sustentabilidade agrícola e econômica, além de servir como alicerce para o controle desses insetos-praga na cultura da soja.

4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Localização

O experimento será desenvolvido na casa-de-vegetação e nos Laboratórios de Acarologia Agrícola (LABAcaro), do Departamento de Fitossanidade, Laboratório de Análises de Sementes do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” (FAEM/UFPel) em Pelotas/RS, no Instituto de Ciências Biológicas-ICB, da Universidade Federal do Rio Grande (FURG), em Rio Grande/RS.

4.2 Material vegetal

Os cinco genótipos de soja 101 (REC 101): BRS 6203 RR, BRS 391, BMX ICONE IPRO, BMX Valente RR e TEC IRGA 6070 RR serão semeados em vasos com capacidade de 18 L (30cm de diâmetro superior x 30cm de altura x 25,5cm de diâmetro inferior), contendo substrato da marca comercial Mecplant® (composição: casca de pinus, vermiculita, corretivo de acidez e macronutrientes), irrigados conforme a demanda necessária para a cultura e mantidos em casa-de-vegetação com temperatura e umidade controlada na Universidade Federal de Pelotas (FARIAS et al., 2007).

4.3 Estabelecimento e manutenção da criação

Para a realização do experimento será mantida uma criação de C. includens em sala climatizada (temperatura 25 ± 2ºC, umidade relativa 70 ± 10% e fotofase 14 horas) no Laboratório de Acarologia Agrícola (LABAcaro) do Departamento de Fitossanidade, da Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” (FAEM)/ UFPel\.
As lagartas serão alimentadas com dieta artificial conforme Greene, Lepla e Dickerson (1976), enquanto os adultos receberão dieta líquida a base mel. A criação seguirá o método descrito por Parra (2001).
Para a condução dos experimentos serão utilizadas lagartas no estádio de desenvolvimento L3 (30 instar).

4.4 Preparo do material vegetal para avaliações

Os cinco genótipos de soja serão avaliados sob duas condições, sem danos e com danos alimentares. Nas plantas expostas à herbivoria serão liberadas dez lagartas de terceiro instar (STACKE et al., 2018), para cada vaso (plantas em estádio V4).
O delineamento de blocos ao acaso, contendo 10 repetições (plantas) para cada genótipo, serão mantidas em casa-de-vegetação. As plantas submetidas aos danos (com exposição às lagartas) serão isoladas em gaiolas e as avalições irão ocorrer nos períodos de 0, 24, 48 e 72 h. Após cada período de exposição, serão realizadas as avaliações de tricomas glandulares e metabólitos secundários flavonoides.
Após cada avaliação, as lagartas serão retiradas para que a planta complete seu ciclo e produza sementes para serem posteriormente avaliadas quanto a qualidade fisiológica.

4.5 Localização espacial e densidade de tricomas

Os materiais para avaliação (folhas) serão coletados diariamente após cada período de exposição (0, 24, 48, 72 e 96h). As análises serão realizadas em cada repetição de plantas com danos e sem danos por lagartas. As avaliações serão realizadas no Laboratório do Instituto de Ciências Biológicas-ICB, da Universidade Federal do Rio Grande (FURG).
Na avaliação da densidade de tricomas (DT) será utilizado um microscópio estereoscópico com aumento 40 vezes. A contagem será realizada em discos de 0,5 cm de diâmetro retirados de locais equidistantes da nervura central na face adaxial das folhas ( com e sem exposição às lagartas). Serão utilizados dois discos por estrato foliar (Apical, mediano e basal), totalizando seis discos por planta, serão utilizadas médias dos valores contabilizados e estratos homogenizado.
A espessura foliar (EF) será realizada retirando- se nove discos foliares de 1,9 cm de diâmetro (2,83 cm²) por parcela das 10 folhas por estrato, os discos serão retirados em folhas escolhidas aleatoriamente e também em locais aleatórios na folha, os discos serão acondicionados em sacos de papel e mantidos em estufa de ventilação forçada à 70º C para secagem até atingirem peso constante, o que ocorrerá em torno de 48h, para determinação da massa seca.


4.6 Determinação de flavonoides em folhas de genótipos de soja por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência aclopado a espectrofotômetro de massas (HPLC/MS)

Os trifolíolos serão colhidos manualmente pela manhã (08:30-9:00), a cada período sem e com exposição às lagartas (0, 24, 48, 72 e 96h). Após, serão colocados em caixa de isopor contendo nitrogênio líquido e armazenados em ultrafreezer a -80°C até a extração e quantificação dos flavonoides.
As avaliações serão realizadas a cada duas semanas, no período compreendido de março a junho, para descartar a influência de outros fatores na expressão dos flavonoides, a fim de confirmar os perfis metabólicos.
A extração inicial dos compostos fenólicos (flavonoides) será baseada no método descrito por Frighetto et al. (2012), com modificações. Uma alíquota de 0,250 g de folhas frescas, de cada tratamento, será macerada em nitrogênio e extraída em aproximadamente 1,50 mL de metanol em água (80% MeOH) e sonicada por 20 min em banho de ultrassom. Posteriormente, as amostras serão filtradas através de um filtro de membrana de nylon 0,22 mM. As análises serão realizadas em triplicata.
Após o preparo das amostras, 10 µL serão injetados em um HPLC acoplado a um espectrômetro de massa de alta resolução para análise e quantificação dos compostos. A separação cromatográfica dos compostos ocorrerá através de coluna C18, fase reversa. A fase móvel será composta de ácido acético 2% (HOAc), solvente A, e uma solução composta por metanol, ácido ácetico e água (MeOH:HOAc:H2O; 18:1:1), solvente B.
A análise quantitativa, será realizada através da curva de calibração para cada padrão comercial fenólico disponível (Kaempferol ≥ 97%, 3,4′,5,7-Tetrahydroxyflavone; Rutina ≥ 95%, Quercetin-3-rutinoside; Genisteína ≥ 98%, 4′,5,7-Trihydroxyisoflavone; Daidzina ≥ 98%, 4′,7-Dihydroxy¬iso¬flavone). Os quais, serão identificados por meio da comparação de espectro e tempo de retenção dos padrões com o espectro e tempo de retenção de cada amostra analisada.
Os dados serão verificados quanto ao atendimento dos pressupostos de normalidade e homocedasticidade para posterior análise de variância (ANOVA).

4.7 Avaliação da qualidade fisiológica das sementes

As sementes serão coletadas após as plantas completarem seu ciclo em casa-de-vegetação. Serão analisadas as sementes oriundas de cada genótipo, com e sem exposição às lagartas. As análises serão realizadas no Laboratório de Análise de Sementes e na área experimental do Departamento de Fitotecnia/FAEM/UFPel.
Serão realizados os seguintes testes:
Teor de água: Será realizado através do método estufa a 105ºC, 24 horas, 4 repetições de 50 sementes serão colocadas em uma estufa com temperatura de 105°c por 24 horas. Passado o tempo determinado, as amostras serão retiradas da estufa e levadas ao dessecador com sílica-gel ativada por 10 minutos e posteriormente serão pesadas novamente para obtenção do peso seco (BRASIL, 2009).
Germinação (G): O teste de germinação será realizado utilizando quatro repetições para cada genótipo , contendo quatro subamostras de 50 sementes, semeadas em rolos de papel tipo germitest®, umedecidas com água destilada na proporção de 2,5 vezes o peso do papel. Os rolos serão colocados em germinadores na temperatura de 25ºC. A avaliação da germinação será realizada aos 8 dias, na qual será determinada o percentagem de plântulas normais e anormais obtendo o resultado da germinação de acordo com as Regras para Análise de Semente (BRASIL, 2009).
Primeira contagem de germinação (PCG): A avaliação será realizada concomitante ao teste de germinação, a qual realizada aos 5 dias após a semeadura, na qual será determinada o percentagem de plântulas normais e anormais (BRASIL, 2009).
Envelhecimento acelerado (EA): Serão utilizadas caixas tipo “gerbox” (11,0 x 11,0 x 3,5cm) possuindo, suspensa em seu interior, tela de alumínio, onde as sementes ficarão distribuídas de maneira uniforme. No interior de cada caixa serão depositados 40 mL de água destilada, estabelecendo um ambiente com aproximadamente 88% de umidade relativa, adaptando a metodologia descrita por Jianhua & McDonald (1996). As caixas tampadas serão mantidas na BOD a 41ºC por 72 horas. Ao término do período de exposição na BOD será montado o teste de germinação. As avaliações serão reaçizadas no quinto dia após semeadura e os resultados expressos em porcentagem de plântulas normais para cada lote.
Teste de tetrazólio (TZ): Será realizado com duas sub amostras de 50 sementes por repetição, as quais serão colocadas para embeber em papel de geminação por 16 horas e em estufa regulada a 25ºC. Após esse período, as sementes serão transferidas para copos plásticos, totalmente imersas em solução de tetrazólio (2,3,5-trifenil-cloreto-detetrazólio) na concentração de 0,075% e acondicionadas em câmaras BOD a 40ºC por três horas, no escuro. Após a coloração as sementes serão lavadas em água corrente e avaliadas individualmente com relação aos níveis de vigor (classe TZ 1- 3), a viabilidade (classe TZ 1-5). Os resultados serão expressos em porcentagem (FRANÇA NETO et al.,1999).
Emergência em campo (EC): será conduzido em canteiros, tendo como substrato solo oriundo de um planossolo da unidade de mapeamento Pelotas. Para cada lote serão utilizadas 8 linhas de 1,20 metros de comprimento, com espaçamento de 10 centímetros entre linhas, sendo distribuídos ao acaso os lotes em cada linha dentro dos blocos. Serão semeadas 25 sementes por linha e a será contagem realizada quando ocorrer a estabilização da emergência.

- Disponibilizar informações quanto a interferência dos tricomas glandulares e dos flavonoides na resistência de genótipos de soja contra a herbivoria da lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) associando com a qualidade fisiológica de sementes de soja.
- Contribuir na seleção de genótipos com característica de resistência à C. includens, que servirão como base de dados para pesquisas de novos produtos, para a implementação em programas de melhoramento tradicional da cultura, como nas técnicas de biotecnologia aplicada às sementes.
- Selecionar genótipos de soja com característica de resistência que contribuam como base de dados, para pesquisas de novos produtos e na implementação em programas de melhoramento da cultura.
- Realizar estudos referentes a qualidade fisiológica dos genótipos em estudo, a fim de contribuir com informações na escolha de genótipos, para a obtenção de incremento na produtividade de sementes.
- Produzir material bibliográfico para divulgação dos resultados em âmbito nacional e internacional. As informações obtidas serão publicadas em revistas especializadas de modo a disponibilizar as informações científicas.