Nome do Projeto
Bacillus thuringiensis para utilização no controle de pragas agrícolas
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
05/06/2025 - 06/06/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A segurança alimentar global é um desafio contínuo enfrentado pela agricultura moderna, que não apenas visa garantir a produção de alimentos em quantidade suficiente, mas também promover práticas sustentáveis que minimizem o impacto ambiental e protejam a biodiversidade. A soja Glycine max (L.) Merrill é uma das culturas economicamente mais importantes do mundo (Baraibar e Deutsch, 2023). O Brasil é atualmente o maior produtor e exportador mundial de soja, com uma produção de aproximadamente 147.382 milhões de toneladas e uma produtividade de 3,2 ton.ha-1 na safra de 2023/2024.
Apesar da grande produtividade alcançada no Brasil, a soja enfrenta problemas fitossanitários. Entre os insetos-praga que afetam a produção de soja, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797), também conhecida como lagarta-do-cartucho e Spodoptera eridania (Stoll, 1782) (Lepidoptera: Noctuidae) ganham destaque devido ao seu potencial de causar desfolha e promover injúrias em vagens e grãos.
A capacidade destas pragas desenvolverem resistência a diferentes métodos de controle agrícola, como o controle químico, que representa 80% do controle, vem aumentando a complexidade de manejo destas pragas como descrito por KASOMA et al. 2024. Como alternativa, surge o uso do controle biológico baseado na bactéria Bacillus thuringiensis (Bt).
Bacillus thuringiensis é uma bactéria em forma de bastonete Gram-positiva, aeróbica ou facultativamente anaeróbica, naturalmente encontrada no solo (Rasko et al., 2005). Durante a esporulação, na fase estacionária do seu ciclo produz inclusões cristalinas, que são eficazes contra insetos pragas, e contra mosquitos vetores de doenças humanas, como a dengue e a malária (Bravo et al., 2011). Estes cristais são compostos por uma ou mais proteínas denominadas Cry (Inseticidal Crystal Proteins) e Cyt (Inseticidal Cytolitic Proteins), também chamadas de δ-endotoxinas ( Bravo et al., 2007). Determinadas cepas de B. thuringiensis sintetizam outras proteínas tóxicas durante a fase de crescimento vegetativo, as quais não formam cristais e não tem homologia com as toxinas Cry. Estas toxinas são denominadas de Vips (Vegetative Inseticidal Proteins) (Schnepf et al., 1998; Pinto; Fiúza, 2008; Werneck et al., 2008).
As proteínas Cry têm mostrado atividade inseticida altamente específica entre as diversas ordens de insetos, como: Lepidoptera, Diptera, Coleoptera (Zhong et al., 2000); Hymenoptera, Hemiptera, Orthoptera, Isoptera e Malophaga (De Maagd et al., 2001), e ainda, para outros organismos, como, nematódeos (Marroquin et al., 2000), ácaros e protozoários (Schnepf et al., 1998). A especificidade das toxinas de Bt baseia-se na capacidade dessas proteínas de se ligarem a receptores específicos no intestino médio dos insetos, onde causam a formação de poros na membrana celular e levam à lise celular, resultando na morte do inseto por septicemia. Esta seletividade torna o Bt uma alternativa altamente atraente aos inseticidas químicos, pois reduz significativamente os impactos adversos sobre organismos não-alvo, incluindo humanos e outros vertebrados (Luski et al. 2024).
O objetivo deste estudo é cultivar diferentes cepas de Bt, caracterizar o crescimento da bactéria e analisar a produção das endotoxinas durante a fase de esporulação a fim de avaliar a eficácia das toxinas de Bt contra pragas agrícolas, especialmente linhagens suscetíveis e resistentes de Spodoptera frugiperda, Chrysodeixis includens e Rachiplusia nu.
Objetivo Geral
Cultivar diferentes cepas de Bt, caracterizar o crescimento da bactéria e analisar a produção das endotoxinas durante a fase de esporulação a fim de avaliar a eficácia das toxinas de Bacillus thuringiensis contra pragas agrícolas, especialmente S. frugiperda, C. includens e R. nu.
Justificativa
As pragas agrícolas causam significativas perdas econômicas na agricultura. A capacidade destas pragas desenvolverem resistência a diferentes métodos de controle agrícola, como o controle químico, que representa 80% do controle, vem aumentando a complexidade de manejo destas pragas como descrito por KASOMA et al. 2024. Como alternativa, surge o uso do controle biológico baseado na bactéria Bacillus thuringiensis (Bt).
Metodologia
Cultivo de Bacillus thuringiensis
Os isolados de B. thuringiensis serão provenientes da bacterioteca do Laboratório de Microbiologia (Biotecnologia/CDTec/UFPel). As bactérias serão recuperadas em meio de cultura Infusão de Cérebro e coração (BHI) e incubados a 28 ºC, cultivadas em balões contendo 200 mL de meio NYSM (Yousten 1984) e incubados em agitador orbital a 28 ºC a 150 rpm por 72 h. A esporulação será verificada por microscopia. Quando aproximadamente 90% da cultura estiver esporulada, serão aquecidas a 80 ºC durante 15 minutos para eliminar as formas vegetativas. Em todas as culturas será realizada a técnica de coloração de Gram e a concentração determinada por diluição decimal seriada seguida de cultivo em placas de petri e e posterior contagem de colônias (UFC/mL) em placas de contendo Agar nutriente ISSO e BHI. Em seguida, as culturas serão armazenadas sob refrigeração (4 ºC) para utilização nos bioensaios.
Caracterização proteica de Bt
A caracterização das proteínas expressas durante o cultivo será realizada a partir de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) corado com Comassie blue. A confirmação das proteínas expressas no isolado será por meio de sequenciamento completo de isolados bacterianos, utilizando a plataforma Illumina. A análise shotgun, a partir do kit Nextera XT, que contém os primers dos adaptadores necessários ao sequenciamento, com a cobertura de 2 milhões reads/2x250 (aproximadamente 200 leituras do mesmo material a fim de comparação). Os dados brutos são entregues via fastQ, e analisados via plataforma NCBI GenBank.
Também serão submetidas amostras para análise transcriptômica, via RNA seq. O RNA-seq usa sequenciamento de alto rendimento de ácidos nucleicos para determinar a sequência de nucleotídeos de moléculas de RNA.
O RNA isolado é transcrito reversamente e convertido em cDNA, que é então amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e fragmentado em sequências curtas. Após o processamento das moléculas de RNA, a biblioteca de RNA-seq se torna a entrada para uma plataforma de sequenciamento de leituras, visualizações e downloads. A facilidade do RNA-seq é que permite a visualização de somente as proteínas expressas no momento. Serão submetidas amostras na fase esporulativa.
Screening em dieta artificial do material isolado para identificação da concentração letal para as espécies citadas
Para este ensaio serão utilizadas doses com concentrações variando de 109 até 104, por meio de diluição. Estas doses, abrangem as recomendadas em materiais comerciais já disponíveis no mercado. As dietas serão cortadas em cubos com 1cm3 e submersas em calda na dose respectiva por 2 segundos. Após a dieta será reservada em uma bandeja forrada com papel toalha e mantidos ao abrigo da luz solar até secagem (em torno de 30 minutos). As dietas serão dispostas bandejas plásticas com 16 células (5,5 centímetros de comprimento × 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de altura por poço) totalizando três bandejas cada tratamento (n= 48), em seguida serão adicionadas cuidadosamente com um pincel uma lagarta neonata <24 horas de eclosão da espécie respectiva ao bioensaio.
Após, as bandejas serão fechadas e a mortalidade será avaliada 72 e 120 horas após a instalação do experimento e quando a dieta for totalmente consumida, será fornecida um novo cubo de dieta sem tratamento. Aos 12 dias os insetos vivos serão pesados, e após será avaliado diariamente até a data de pupação, verificação de sexo, data de emergência, viabilidade larval.
A partir da mortalidade, será traçado uma curva dose-resposta para computação da concentração letal para 30; 50 e 90 %. Também serão obtidas informações ao longo do ciclo como, o peso aos 12 dias; O período e viabilidade larval; O período e viabilidade pupal, e a razão sexual.
Tabela de vida e fertilidade com as concentrações de CL 30, CL 50 e CL90 em folhas de milho convencional (não Bt) e VTPRO3 (para linhagens de S. frugiperda) e folhas de soja convencional e Intacta IPRO (para C. includens e R. nu)
As sementes de milho VT PRO3 (8088) e convencional (Dekalb 3800RR2) e Soja Convencional (não bt- Monsoy 8329), soja Intacta (IPRO- BMX FIBRAIPRO) serão semeadas em vasos plásticos de 12 litros (3 sementes/vaso) contendo terra e material vegetal em uma proporção de 3:1. Os vasos serão mantidos em casa de vegetação em condições controladas de desenvolvimento (Temperatura de 25 ± 3ºC, Umidade Relativa e fotofase 14h). Na semeadura, será aplicado adubo químico (NPK; 5-25-25) de acordo com as recomendações técnicas para soja nos vasos de soja e nos vasos de milho a formulação de NPK foi 20-25-25, e 100 kg/ha de ureia no estádio fenológico v5. Devido ao efeito do tratamento de sementes, as plantas só serão utilizadas após estádio fenológico v5.
Para utilização de folhas, as folhas de milho do terço médio serão destacadas e cortadas em retângulos com uma tesoura, com aproximadamente 5 centímetros de comprimento e as folhas de soja serão destacadas do trifólio, sendo utilizada uma folha para cada repetição. Serão utilizadas as concentrações de CL 30, CL 50 e CL90 onde serão realizadas 160 repetições para cada tratamento (10 placas). Cada folha será submersa por 2 segundos na respectiva calda do respectivo tratamento. Após as folhas serão reservadas em uma bandeja forrada com papel toalha e mantidas ao abrigo da luz solar até secagem (em torno de 30 minutos). Cada folha será adicionada a cada poço da placa e em seguida serão adicionadas, cuidadosamente com um pincel, uma lagarta neonata <24 horas de eclosão da espécie que o ensaio está sendo realizado.
Após, as bandejas serão fechadas e a mortalidade será avaliada 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a instalação do experimento e as folhas serão repostas diariamente até a pupação. Os parâmetros analisados serão avaliação da sobrevivência larval, peso médio lagarta (12 dias) e de pupa, períodos de neonata a pupa e neonata a emergência do adulto, longevidade e porcentagem de emergência dos adultos, razão sexual e fertilidade das fêmeas. Para avaliar a fertilidade, serão sexadas pupas separando macho e fêmea individualizados até a emergência. Após emergência serão formados casais em gaiolas individuais e realizada contagem de ovos e frequência de oposição.
Compatibilidade físico-química e biológica em mistura com defensivos utilizados no manejo de soja e milho
Para o ensaio de compatibilidade físico-químico serão feitas misturas em becker com as concentrações de CL 30, 50 e 90 com e sem associação a goma xantana e misturando aos agrotóxicos registrados para manejo: herbicidas: glifosato e cletodim; fungicidas: mancozebe e piraclostrobina+ metconazol; inseticidas: espinetoram, clorantraniliprole, teflubenzurom, cipermetrina, imidacloprido+ beta-ciflutrina e acefato.
Serão utilizados dose máxima de bula de cada produto, adicionando por último o produto proveniente do B. thuringiensis. Após a adição da dose de Bt, a calda será mantida sob agitação durante 1 minuto com auxílio de um agitador magnético NT 100. Decorrido esse tempo, as caldas serão mantidas em repouso para as avaliações. Como testemunha (controle negativo) será mantido um béquer somente com a presença de defensivo em mistura com água. As avaliações de compatibilidade serão feitas aos 5, 10 e 20 minutos após término da agitação, avaliando-se a formação de fases na calda, conforme a metodologia proposta por ABNT NBR13875 de 12/2014, e o pH e temperatura da calda em cada avaliação utilizando um Phmetro de Bolso AK90 New – Hidro, sendo: Compatível- Homogêneo em todos os prazos de avaliação; compatível sob agitação- Homogêneo sob agitação; Incompatível/heterogêneo- Heterogêneo em qualquer avaliação.
Para compatibilidade biológica serão utilizadas placas de petri 90 x 15 mm com camada uniforme de meio Agar ISO, autoclavado. Serão utilizadas as mesmas doses e interações do ensaio de compatibilidade física, porém utilizando agua autoclavada. Será espalhado 70 microlitros do produto oriundo de B. thuringiensis por toda a superfície da placa, e será cortado um círculo de papel filtro de 0,25 cm de raio, onde serão submersos em uma calda com o defensivo e após alocados sobre a superfície do meio de cultura. Em cada placa considerando uma repetição serão adicionados 3 papeis uniformemente distribuídos (120°) e serão utilizadas 3 repetições de cada interação. Após a placa é fechada e vedada com plástico film e mantidas em câmara BOD por 30 horas para crescimento. Após será registrado com foto e avaliado a formação de halos de crescimento e inibição e contagem de UFC/cm2.
Tempo de prateleira
Para este bioensaio serão utilizados frascos de vidro Âmbar hermeticamente fechados e mantidos em 3 ambientes, BOD a 35°C e geladeira a 4°C, e em de temperatura ambiente(25°C). A cada 2 meses serão realizados bioensaios em dieta replicando a metodologia do tópico “Screening em dieta artificial” testando as concentrações de CL 30, 50 e 90 nas linhagens de S.frugiperda e C. includens e R. nu.
Ao fim de 12 meses, serão comparadas as variações de eficiência de cada tratamento.
Eficiência agronômica no campo
A eficiência agronômica dos materiais selecionados utilizando as doses das concentrações de CL 30, 50 e 90. Serão semeados milho VT PRO3 (8088) e convencional (Dekalb 3800RR2) e Soja Convencional (não bt- Monsoy 8329), soja Intacta (IPRO- BMX FIBRAIPRO). Para milho a pulverização ocorrerá no estágio v2 enquanto para soja em v5(antes do fechamento de linha) onde serão pulverizados os tratamentos compatíveis pelos resultados do tópico “Compatibilidade físico-química e biológica”.
Serão demarcadas parcelas de 3 metros de largura por 4 metros de comprimento, em blocos casualizados, com 4 blocos, consistindo em uma repetição por bloco. Os produtos serão pulverizados com auxílio de um pulverizador costal a CO2 pressurizado, utilizando bico TeeJet TP8002 do tipo leque simples e volume de calda de 150 L/ha.
Os isolados de B. thuringiensis serão provenientes da bacterioteca do Laboratório de Microbiologia (Biotecnologia/CDTec/UFPel). As bactérias serão recuperadas em meio de cultura Infusão de Cérebro e coração (BHI) e incubados a 28 ºC, cultivadas em balões contendo 200 mL de meio NYSM (Yousten 1984) e incubados em agitador orbital a 28 ºC a 150 rpm por 72 h. A esporulação será verificada por microscopia. Quando aproximadamente 90% da cultura estiver esporulada, serão aquecidas a 80 ºC durante 15 minutos para eliminar as formas vegetativas. Em todas as culturas será realizada a técnica de coloração de Gram e a concentração determinada por diluição decimal seriada seguida de cultivo em placas de petri e e posterior contagem de colônias (UFC/mL) em placas de contendo Agar nutriente ISSO e BHI. Em seguida, as culturas serão armazenadas sob refrigeração (4 ºC) para utilização nos bioensaios.
Caracterização proteica de Bt
A caracterização das proteínas expressas durante o cultivo será realizada a partir de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) corado com Comassie blue. A confirmação das proteínas expressas no isolado será por meio de sequenciamento completo de isolados bacterianos, utilizando a plataforma Illumina. A análise shotgun, a partir do kit Nextera XT, que contém os primers dos adaptadores necessários ao sequenciamento, com a cobertura de 2 milhões reads/2x250 (aproximadamente 200 leituras do mesmo material a fim de comparação). Os dados brutos são entregues via fastQ, e analisados via plataforma NCBI GenBank.
Também serão submetidas amostras para análise transcriptômica, via RNA seq. O RNA-seq usa sequenciamento de alto rendimento de ácidos nucleicos para determinar a sequência de nucleotídeos de moléculas de RNA.
O RNA isolado é transcrito reversamente e convertido em cDNA, que é então amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e fragmentado em sequências curtas. Após o processamento das moléculas de RNA, a biblioteca de RNA-seq se torna a entrada para uma plataforma de sequenciamento de leituras, visualizações e downloads. A facilidade do RNA-seq é que permite a visualização de somente as proteínas expressas no momento. Serão submetidas amostras na fase esporulativa.
Screening em dieta artificial do material isolado para identificação da concentração letal para as espécies citadas
Para este ensaio serão utilizadas doses com concentrações variando de 109 até 104, por meio de diluição. Estas doses, abrangem as recomendadas em materiais comerciais já disponíveis no mercado. As dietas serão cortadas em cubos com 1cm3 e submersas em calda na dose respectiva por 2 segundos. Após a dieta será reservada em uma bandeja forrada com papel toalha e mantidos ao abrigo da luz solar até secagem (em torno de 30 minutos). As dietas serão dispostas bandejas plásticas com 16 células (5,5 centímetros de comprimento × 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de altura por poço) totalizando três bandejas cada tratamento (n= 48), em seguida serão adicionadas cuidadosamente com um pincel uma lagarta neonata <24 horas de eclosão da espécie respectiva ao bioensaio.
Após, as bandejas serão fechadas e a mortalidade será avaliada 72 e 120 horas após a instalação do experimento e quando a dieta for totalmente consumida, será fornecida um novo cubo de dieta sem tratamento. Aos 12 dias os insetos vivos serão pesados, e após será avaliado diariamente até a data de pupação, verificação de sexo, data de emergência, viabilidade larval.
A partir da mortalidade, será traçado uma curva dose-resposta para computação da concentração letal para 30; 50 e 90 %. Também serão obtidas informações ao longo do ciclo como, o peso aos 12 dias; O período e viabilidade larval; O período e viabilidade pupal, e a razão sexual.
Tabela de vida e fertilidade com as concentrações de CL 30, CL 50 e CL90 em folhas de milho convencional (não Bt) e VTPRO3 (para linhagens de S. frugiperda) e folhas de soja convencional e Intacta IPRO (para C. includens e R. nu)
As sementes de milho VT PRO3 (8088) e convencional (Dekalb 3800RR2) e Soja Convencional (não bt- Monsoy 8329), soja Intacta (IPRO- BMX FIBRAIPRO) serão semeadas em vasos plásticos de 12 litros (3 sementes/vaso) contendo terra e material vegetal em uma proporção de 3:1. Os vasos serão mantidos em casa de vegetação em condições controladas de desenvolvimento (Temperatura de 25 ± 3ºC, Umidade Relativa e fotofase 14h). Na semeadura, será aplicado adubo químico (NPK; 5-25-25) de acordo com as recomendações técnicas para soja nos vasos de soja e nos vasos de milho a formulação de NPK foi 20-25-25, e 100 kg/ha de ureia no estádio fenológico v5. Devido ao efeito do tratamento de sementes, as plantas só serão utilizadas após estádio fenológico v5.
Para utilização de folhas, as folhas de milho do terço médio serão destacadas e cortadas em retângulos com uma tesoura, com aproximadamente 5 centímetros de comprimento e as folhas de soja serão destacadas do trifólio, sendo utilizada uma folha para cada repetição. Serão utilizadas as concentrações de CL 30, CL 50 e CL90 onde serão realizadas 160 repetições para cada tratamento (10 placas). Cada folha será submersa por 2 segundos na respectiva calda do respectivo tratamento. Após as folhas serão reservadas em uma bandeja forrada com papel toalha e mantidas ao abrigo da luz solar até secagem (em torno de 30 minutos). Cada folha será adicionada a cada poço da placa e em seguida serão adicionadas, cuidadosamente com um pincel, uma lagarta neonata <24 horas de eclosão da espécie que o ensaio está sendo realizado.
Após, as bandejas serão fechadas e a mortalidade será avaliada 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a instalação do experimento e as folhas serão repostas diariamente até a pupação. Os parâmetros analisados serão avaliação da sobrevivência larval, peso médio lagarta (12 dias) e de pupa, períodos de neonata a pupa e neonata a emergência do adulto, longevidade e porcentagem de emergência dos adultos, razão sexual e fertilidade das fêmeas. Para avaliar a fertilidade, serão sexadas pupas separando macho e fêmea individualizados até a emergência. Após emergência serão formados casais em gaiolas individuais e realizada contagem de ovos e frequência de oposição.
Compatibilidade físico-química e biológica em mistura com defensivos utilizados no manejo de soja e milho
Para o ensaio de compatibilidade físico-químico serão feitas misturas em becker com as concentrações de CL 30, 50 e 90 com e sem associação a goma xantana e misturando aos agrotóxicos registrados para manejo: herbicidas: glifosato e cletodim; fungicidas: mancozebe e piraclostrobina+ metconazol; inseticidas: espinetoram, clorantraniliprole, teflubenzurom, cipermetrina, imidacloprido+ beta-ciflutrina e acefato.
Serão utilizados dose máxima de bula de cada produto, adicionando por último o produto proveniente do B. thuringiensis. Após a adição da dose de Bt, a calda será mantida sob agitação durante 1 minuto com auxílio de um agitador magnético NT 100. Decorrido esse tempo, as caldas serão mantidas em repouso para as avaliações. Como testemunha (controle negativo) será mantido um béquer somente com a presença de defensivo em mistura com água. As avaliações de compatibilidade serão feitas aos 5, 10 e 20 minutos após término da agitação, avaliando-se a formação de fases na calda, conforme a metodologia proposta por ABNT NBR13875 de 12/2014, e o pH e temperatura da calda em cada avaliação utilizando um Phmetro de Bolso AK90 New – Hidro, sendo: Compatível- Homogêneo em todos os prazos de avaliação; compatível sob agitação- Homogêneo sob agitação; Incompatível/heterogêneo- Heterogêneo em qualquer avaliação.
Para compatibilidade biológica serão utilizadas placas de petri 90 x 15 mm com camada uniforme de meio Agar ISO, autoclavado. Serão utilizadas as mesmas doses e interações do ensaio de compatibilidade física, porém utilizando agua autoclavada. Será espalhado 70 microlitros do produto oriundo de B. thuringiensis por toda a superfície da placa, e será cortado um círculo de papel filtro de 0,25 cm de raio, onde serão submersos em uma calda com o defensivo e após alocados sobre a superfície do meio de cultura. Em cada placa considerando uma repetição serão adicionados 3 papeis uniformemente distribuídos (120°) e serão utilizadas 3 repetições de cada interação. Após a placa é fechada e vedada com plástico film e mantidas em câmara BOD por 30 horas para crescimento. Após será registrado com foto e avaliado a formação de halos de crescimento e inibição e contagem de UFC/cm2.
Tempo de prateleira
Para este bioensaio serão utilizados frascos de vidro Âmbar hermeticamente fechados e mantidos em 3 ambientes, BOD a 35°C e geladeira a 4°C, e em de temperatura ambiente(25°C). A cada 2 meses serão realizados bioensaios em dieta replicando a metodologia do tópico “Screening em dieta artificial” testando as concentrações de CL 30, 50 e 90 nas linhagens de S.frugiperda e C. includens e R. nu.
Ao fim de 12 meses, serão comparadas as variações de eficiência de cada tratamento.
Eficiência agronômica no campo
A eficiência agronômica dos materiais selecionados utilizando as doses das concentrações de CL 30, 50 e 90. Serão semeados milho VT PRO3 (8088) e convencional (Dekalb 3800RR2) e Soja Convencional (não bt- Monsoy 8329), soja Intacta (IPRO- BMX FIBRAIPRO). Para milho a pulverização ocorrerá no estágio v2 enquanto para soja em v5(antes do fechamento de linha) onde serão pulverizados os tratamentos compatíveis pelos resultados do tópico “Compatibilidade físico-química e biológica”.
Serão demarcadas parcelas de 3 metros de largura por 4 metros de comprimento, em blocos casualizados, com 4 blocos, consistindo em uma repetição por bloco. Os produtos serão pulverizados com auxílio de um pulverizador costal a CO2 pressurizado, utilizando bico TeeJet TP8002 do tipo leque simples e volume de calda de 150 L/ha.
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se que este projeto promova desenvolvimento e inovação frente a obtenção de novas estratégias para o controle de pragas agrícolas, especialmente S. frugiperda, C. includens e R. nu.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| DANIEL BERNARDI | 3 | ||
| FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE | 3 | ||
| JUAREZ DA SILVA ALVES | |||
| LARISSA PASQUALOTTO | |||
| NEIDA LUCIA CONRAD |