Nome do Projeto
Construção de um clone infecioso para estudos com Physalis rugose mosaic virus (PhyRMV)
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
30/06/2025 - 23/06/2028
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O cultivo de fisális (Physalis peruviana L.) vem se mostrando promissor para pequenos e médios produtores, devido ao baixo custo de implantação da cultura e alto valor agregado aos frutos. As plantas de fisális podem ser acometidas por diversos fatores que comprometem o cultivo e produção, dentre estes fatores, recentemente foi identificada uma doença viral comprometendo a produção de frutos de fisális em três estados brasileiros, sendo identificado o agente viral como Physalis rugose mosaic virus (PhyRMV). Além de infectar plantas de fisális, o vírus tem a capacidade de infectar outras solanáceas como plantas de tabaco e tomate. Devido a estes aspectos, é importante conduzir mais estudos sobre o agente viral para elaborar ferramentas de controle e garantir a produção das culturas que podem ser afetadas pelo vírus. Desta forma, o objetivo da presente pesquisa é a construção de um clone infeccioso do PhyRMV para estudos posteriores com o agente viral. Para isto, o RNA do vírus será transformado em cDNA e acoplado em um plasmídeo com o kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning, o qual faz a montagem de fragmentos de DNA de maneira rápida e acurada. Posteriormente o clone será agroinoculado em plantas de fisális e será observado a reprodução dos sintomas da doença viral bem como a sua incidência em outras plantas de interesse econômico.
Objetivo Geral
Obter um clone infeccioso com o vírus Physalis rugose mosaic virus (PhyRMV) para ser utilizado como ferramenta para caracterização biológica do vírus e posterior utilização como um vetor viral.
Justificativa
Com a obtenção deste clone infeccioso será possível entender o comportamento do vírus em condições de campo e inferir sobre os seus potenciais danos em culturas como a fisalis e outras relacionadas que se encontram nas lavouras.
Metodologia
7.1 Obtenção do RNA viral
A amostra do RNA de plantas infectadas com PhyRMV será cedida pelo Laboratório de Virologia da Universidade Estadual de Santa Catarina (UDESC).
7.2 Manutenção do isolado
Plantas de fisális serão cultivadas durante o período de condução dos experimentos. O isolado de PhyRMV será inoculado mecanicamente nas plantas nos estádios vegetativo e reprodutivo, para manutenção do isolado viral.
7.3 Síntese de cDNA e reação em cadeia da polimerase (PCR) do PhyRMV
Com a amostra de RNA será feita o cDNA através com o kit superscript iV. Posteriormente, será realizada uma reação de PCR com os primers específicos para o PhyRMV, desenhados com a ferramenta de design de primers. E esta PCR será realizada com uma Taq DNA polimerase de alta fidelidade.
7.4 Preparo do vetor plasmidial
O clone infeccioso será feito com o vetor plasmidial pjl89. Com o vetor será realizado uma PCR com os primers específicos e Taq DNA polimerase de alta fidelidade.
7.5 Construção do clone infeccioso
Com as fitas de DNA do vírus e do vetor, será realizada a montagem do clone infeccioso com o Kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning, que consiste na montagem de clones a partir de fitas complementares (as quais são obtidas com a PCR com os primers específicos desenhados com a ferramenta fornecida no site do fabricante do kit). Para reação será seguido o protocolo fornecido pelo fabricante. Após a reação, os produtos gerados serão analisados em gel de agarose 1% corado com GelRed™. Amostras com tamanhos de fragmentos desejados, serão utilizados em transformação em Escherichia coli.
7.6 Transformação em Escherichia coli
O produto da reação de clonagem será introduzido em cepas de Escherichia coli pelo método de choque térmico para multiplicação do clone infeccioso (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Após a formação de colônias contendo o clone infeccioso, estas serão repicadas para meio LB líquido e incubadas por 12 horas a 37°C. Após o período de incubação, as colônias serão submetidas à minipreparação de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). O produto da reação será analisado em gel de 1% corado com GelRed™.
7.7 transformação em Agrobacterium tumefaciens
Para transformação em A. tumafaciens as bactérias serão cultivadas em meio LB contendo 40 mg/L de kanamicina e 20 mg/L de gentamicina, por um período de 12 horas a 28°C. Após isto, as células bacterianas serão colhidas e ressuspensas em tampão de inoculação, feito com 10 mM de MgCl2, 10 mM de MES, 200 μM de acetosiringona, e posteriormente deixadas à temperatura ambiente por pelo menos 4h. Plantas de fisális serão utilizadas para agroinoculação. A inoculação será feita com a injeção de 50 µl da suspensão bacteriana e as plantas serão observadas diariamente para acompanhar a reprodução dos sintomas.
A amostra do RNA de plantas infectadas com PhyRMV será cedida pelo Laboratório de Virologia da Universidade Estadual de Santa Catarina (UDESC).
7.2 Manutenção do isolado
Plantas de fisális serão cultivadas durante o período de condução dos experimentos. O isolado de PhyRMV será inoculado mecanicamente nas plantas nos estádios vegetativo e reprodutivo, para manutenção do isolado viral.
7.3 Síntese de cDNA e reação em cadeia da polimerase (PCR) do PhyRMV
Com a amostra de RNA será feita o cDNA através com o kit superscript iV. Posteriormente, será realizada uma reação de PCR com os primers específicos para o PhyRMV, desenhados com a ferramenta de design de primers. E esta PCR será realizada com uma Taq DNA polimerase de alta fidelidade.
7.4 Preparo do vetor plasmidial
O clone infeccioso será feito com o vetor plasmidial pjl89. Com o vetor será realizado uma PCR com os primers específicos e Taq DNA polimerase de alta fidelidade.
7.5 Construção do clone infeccioso
Com as fitas de DNA do vírus e do vetor, será realizada a montagem do clone infeccioso com o Kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning, que consiste na montagem de clones a partir de fitas complementares (as quais são obtidas com a PCR com os primers específicos desenhados com a ferramenta fornecida no site do fabricante do kit). Para reação será seguido o protocolo fornecido pelo fabricante. Após a reação, os produtos gerados serão analisados em gel de agarose 1% corado com GelRed™. Amostras com tamanhos de fragmentos desejados, serão utilizados em transformação em Escherichia coli.
7.6 Transformação em Escherichia coli
O produto da reação de clonagem será introduzido em cepas de Escherichia coli pelo método de choque térmico para multiplicação do clone infeccioso (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Após a formação de colônias contendo o clone infeccioso, estas serão repicadas para meio LB líquido e incubadas por 12 horas a 37°C. Após o período de incubação, as colônias serão submetidas à minipreparação de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). O produto da reação será analisado em gel de 1% corado com GelRed™.
7.7 transformação em Agrobacterium tumefaciens
Para transformação em A. tumafaciens as bactérias serão cultivadas em meio LB contendo 40 mg/L de kanamicina e 20 mg/L de gentamicina, por um período de 12 horas a 28°C. Após isto, as células bacterianas serão colhidas e ressuspensas em tampão de inoculação, feito com 10 mM de MgCl2, 10 mM de MES, 200 μM de acetosiringona, e posteriormente deixadas à temperatura ambiente por pelo menos 4h. Plantas de fisális serão utilizadas para agroinoculação. A inoculação será feita com a injeção de 50 µl da suspensão bacteriana e as plantas serão observadas diariamente para acompanhar a reprodução dos sintomas.
Indicadores, Metas e Resultados
Os resultados obtidos com a condução dos trabalhos serão divulgados em congressos, reuniões e simpósios e após a defesa da tese, os dados serão publicados em revistas de inserção nacional e internacional.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| DANIELLE RIBEIRO DE BARROS | 4 | ||
| EMANUELI BIZARRO FURTADO |