Nome do Projeto
Hemosporídeos em aves de rapina estágios exo-eritrocitários e implicações para conservação
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
29/06/2025 - 29/06/2029
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
As aves de rapina, reconhecidas como indicadores ecológicos e essenciais para a manutenção de ecossistemas saudáveis, enfrentam declínios populacionais significativos, destacando a necessidade de ações de conservação. Este estudo investiga a relação entre hemosporídeos, protozoários intracelulares, e aves de rapina atendidas pelo Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre, localizado em uma área de alta relevância ambiental no Sul do Brasil. Os hemosporídeos, que incluem os gêneros Haemoproteus, Leucocytozoon e Plasmodium, são transmitidos por dípteros hematófagos e podem afetar negativamente a saúde dos hospedeiros, causando anemia, letargia e alterações hematológicas e bioquímicas. O estudo visa monitorar todas as aves de rapina desde a admissão até o desfecho final (soltura, destinação ou óbito), utilizando análises hematológicas, bioquímicas e moleculares para avaliar a evolução da parasitemia e suas implicações na saúde e prognóstico. Técnicas de PCR e sequenciamento serão empregadas para identificar linhagens parasitárias, enquanto a histopatologia permitirá descrever características morfológicas dos estágios exo-eritrocitários e as lesões associadas em órgãos de aves que vierem a óbito. As aves de rapina analisadas neste estudo serão provenientes do atendimento clínico realizado pelo Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre, situado em uma área de alta relevância ambiental que abriga aves migratórias e locais, facilitando a transmissão de patógenos entre espécies. Resultados prévios indicam que aves infectadas por hemosporídeos demandam maior tempo de reabilitação e recursos veterinários, comprometendo suas chances de soltura. Este projeto pretende preencher lacunas sobre a dinâmica de infecção e os impactos ecológicos desses parasitas, além de subsidiar estratégias de manejo e reabilitação mais eficazes para aves de rapina. Os achados esperados incluem a identificação de novas linhagens de hemosporídeos, compreensão dos fatores associados à severidade da infecção e propostas de indicadores clínicos para o manejo de aves em reabilitação. Ao ampliar o conhecimento sobre a interação entre hospedeiros e parasitas, este estudo contribuirá para a conservação de rapinantes.

Objetivo Geral

Investigar a presença, diversidade e impactos dos hemosporídeos em aves de rapina atendidas pelo Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre, por meio de análises hematológicas, bioquímicas, moleculares e histopatológicas, visando compreender a dinâmica de infecção, identificar fatores associados à severidade da parasitemia e contribuir para o manejo e conservação dessas espécies em ecossistemas de alta relevância ambiental no sul do Brasil.

Justificativa

As aves de rapina ocupam o topo da cadeia alimentar e exercem papel fundamental no equilíbrio ecológico dos ecossistemas, sendo reconhecidas como importantes bioindicadoras de saúde ambiental. O Brasil, por sua vez, abriga uma rica diversidade de espécies de rapinantes, muitas das quais se encontram ameaçadas por pressões antrópicas e doenças emergentes. Dentre essas doenças, as infecções por parasitas hemosporídeos, como Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon, têm se mostrado relevantes por seu potencial de comprometimento da saúde, da capacidade reprodutiva e da sobrevivência das aves, especialmente em contextos de reabilitação e conservação.
Estudos recentes demonstram que aves de rapina — incluindo espécies migratórias — podem atuar como reservatórios e vetores ecológicos desses hemoprotozoários, favorecendo sua dispersão geográfica e a emergência de novas linhagens parasitárias. Ainda que historicamente considerados de baixa patogenicidade, os hemosporídeos vêm sendo associados a quadros clínicos significativos, além de alterações hematológicas e bioquímicas que influenciam negativamente o prognóstico e a reabilitação de aves acometidas. A identificação de merontes exo-eritrocíticos e suas lesões associadas em tecidos de aves infectadas também sugere um impacto mais profundo desses parasitas na fisiologia e saúde aviária do que se acreditava anteriormente.
Nesse cenário, torna-se essencial investigar a ocorrência, diversidade genética e impactos fisiopatológicos dos hemosporídeos em aves de rapina atendidas em centros de reabilitação, particularmente em regiões de alta relevância ecológica, como a área de influência do Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre (NURFS-CETAS/UFPel), situada nas proximidades de importantes áreas úmidas do sul do Brasil. A integração de técnicas clínicas, laboratoriais, moleculares e histopatológicas permitirá a caracterização abrangente da infecção e de seus efeitos sobre as aves, promovendo avanços no diagnóstico, no manejo clínico e na conservação dessas espécies.
Dessa forma, o presente estudo se justifica por seu potencial de gerar conhecimento inédito sobre a saúde de aves de rapina em reabilitação, identificar possíveis fatores de risco associados à infecção por hemosporídeos e contribuir com subsídios científicos para estratégias mais eficazes de manejo, reabilitação e conservação da avifauna silvestre brasileira.

Metodologia

Delineamento amostral
1. Área de estudo
O estudo será realizado no Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre (NURFS) (31°48’03” S 52°24’30” S) da Universidade Federal de Pelotas. Esse centro recebe anualmente mais de 3.000 animais silvestres provenientes de mais de 25 municípios da região Sul do Brasil.

2. Animais amostrados
Serão coletadas amostras de sangue de todas as aves de rapina atendidas no Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre no momento de sua admissão, e uma vez na semana durante todo o período de tratamento. Nas fichas de recebimento, serão registrados dados relevantes, como a causa do resgate, o local de origem do animal e a identificação da espécie, incluindo nome científico, idade e sexo (quando este puder ser determinado, especialmente em casos de dimorfismo sexual). Todas as aves passarão inicialmente por um exame físico detalhado, cujos achados serão registrados em fichas específicas.
Após o exame clínico, será realizada a coleta de sangue por punção da veia jugular direita, respeitando o limite máximo de 1% do peso corporal do animal (Campbell e Krystan, 2022). Imediatamente após a coleta, serão confeccionados três esfregaços sanguíneos, que serão secos ao ar, fixados com metanol absoluto e corados utilizando a técnica de May-Grünwald Giemsa (Campbell e Krystan, 2022). O restante do sangue será acondicionado em dois tubos: um contendo anticoagulante EDTA, para análises hematológicas e moleculares, e outro sem anticoagulante, destinado ao processamento para análises bioquímicas.

3. Hemograma
Para a realização do hemograma, será utilizada a amostra de sangue coletada em tubo contendo heparina como anticoagulante. A contagem de hemácias e leucócitos será realizada utilizando a solução de Natt e Herrick's como diluente. O procedimento consistirá em pipetar 4 mL da solução de Natt e Herrick's em um tubo de ensaio e adicionar 20 µL de sangue total, misturando cuidadosamente a amostra com o diluente. Em seguida, a mistura será incubada por 30 minutos à temperatura ambiente, com o tubo devidamente fechado. Após a incubação, a amostra será homogeneizada, e uma alíquota será transferida para a câmara de Neubauer para a contagem de leucócitos totais e eritrócitos, conforme descrito por Campbell e Krystan (2022).
O hematócrito e as proteínas plasmáticas totais serão determinados após centrifugação da amostra em centrífuga de micro-hematócrito, a 12.000 g por 5 minutos. Após o processo de centrifugação, a leitura do hematócrito será realizada utilizando uma tabela específica. A determinação das proteínas plasmáticas totais será feita diretamente no plasma, utilizando um refratômetro manual, conforme descrito por Campbell e Krystan (2022). A concentração de hemoglobina será determinada utilizando o método de cianometahemoglobina com o kit comercial da marca Labtest®, seguindo rigorosamente as instruções fornecidas pelo fabricante. A leitura será realizada em espectrofotômetro, após centrifugação da amostra para sedimentação dos núcleos das hemácias.
O diferencial de leucócitos e a avaliação da morfologia celular serão realizados em um dos esfregaços sanguíneos confeccionados previamente. Na região de monocamada, serão contados 100 leucócitos, que serão diferenciados nas seguintes categorias: heterófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos, utilizando um microscópio Nikon E200 em objetiva de 100x. Os índices hematimétricos, incluindo o volume corpuscular médio (VCM) e a concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), serão calculados com base nos valores obtidos durante as análises hematológicas, seguindo as fórmulas descritas na literatura específica (Campbell e Krystan, 2022).]

4. Pesquisa de hemoprotozoários em esfregaço sanguíneo
Os esfregaços de sangue serão examinados por microscopia óptica, em aproximadamente 100-150 campos em objetiva de 40 × e posteriormente em objetiva 100× conforme metodologia descrita por Valkiūnas et al. (2008). A identificação morfológica dos parasitas será realizada seguindo Valkiūnas (2005). A prevalência da infecção por hemosporídeos nos rapinantes será determinada dividindo o número de indivíduos infectados pelo número de indivíduos examinado, sendo o resultado multiplicado por 100 (Bush et al., 1997).

5. Marcadores bioquímicos
As amostras de sangue coletadas em tubos sem anticoagulante serão centrifugadas a 400 g por 5 minutos para a separação do soro. O soro obtido será utilizado para a determinação de marcadores bioquímicos, incluindo alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), creatina quinase (CK), ácido úrico, proteína total, albumina, colesterol e triglicerídeos. As análises serão realizadas utilizando kits comerciais da marca Labtest®, processados em analisador bioquímico automatizado, seguindo as instruções do fabricante.

6. Necropsia e coleta de tecidos
Nas aves que vierem a óbito durante o atendimento, será realizada necropsia com coleta de fragmentos de diferentes órgãos, incluindo encéfalo, fígado, pulmão, rim, baço, coração e trato intestinal. Para análise molecular, uma alíquota de aproximadamente 1 g de cada tecido será acondicionada em tubos estéreis de 1,5 mL e armazenada a -20 °C até a extração do DNA. Os tecidos coletados também serão fixados em formalina tamponada a 10% e embebidos em parafina. Serão confeccionados cortes histológicos com espessura de 4–5 μm, posteriormente corados com hematoxilina e eosina (HE). Nas lâminas histológicas, o tamanho dos merontes e merozoítos será medido e expresso em micrômetros (μm). Além disso, o número de merontes será quantificado sob objetiva de ×40, sendo os resultados apresentados como a média do número de merontes por 10 campos microscópicos (Shokran et al., 2021; Ilgūnas et al., 2022).

7. Extração de DNA, PCR e sequenciamento
Fragmentos de aproximadamente 1 g de diferentes órgãos serão coletados de aves que vierem a óbito. As amostras serão acondicionadas em tubos estéreis de 1,5 mL e armazenadas a -80 °C até o momento da extração do DNA. Além disso, amostras de sangue com heparina serão coletadas e utilizadas para análise molecular.
A extração de DNA será realizada utilizando o kit comercial BioPur Extraction Kit Mini Spin Plus® (Mobius Life Science, Brasil), seguindo rigorosamente as instruções do fabricante. O DNA extraído será eluído em 50 μL de tampão de eluição e armazenado a -20 °C até a realização da PCR.
Para a identificação de hemoparasitas, uma nested PCR será conduzida visando o gene mitocondrial citocromo b (cyt b) de Haemoproteus spp., Plasmodium spp. e Leucocytozoon spp.. A metodologia seguirá o protocolo descrito por Hellgren et al. (2004), com modificações menores. A primeira reação de PCR utilizará os primers externos HaemNFI (5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′) e HaemNR3 (5′- ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′), enquanto os primers internos HaemF (5′- ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3′) e HaemR2 (5′- GCATTATCTGGATGTGATAATGGT-3′), descritos por Bensch et al. (2000), serão utilizados na segunda reação.
As reações de PCR serão realizadas em um volume final de 25 μL contendo 0,6 μM de cada primer (para a primeira reação) ou 0,4 μM (para a segunda reação), 0,2 mM de cada dNTP, 2,5 mM de MgCl₂, 1X de tampão de reação (Invitrogen®, EUA), 1,25 U de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen®, EUA) e 5 μL de DNA genômico (para a primeira reação) ou 2 μL do amplicon diluído (para a segunda reação). O programa térmico incluirá desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 45 segundos, 48 °C por 45 segundos e 72 °C por 45 segundos, com extensão final a 72 °C por 10 minutos.
Os produtos amplificados serão analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% contendo Sybr Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher, EUA) e visualizados sob luz UV. Controles positivos (DNA de Haemoproteus spp. e Plasmodium gallinaceum) e negativos (água ultrapura) serão incluídos em todas as reações para garantir a confiabilidade dos resultados. Amostras positivas serão submetidas a uma digestão enzimática com a enzima EcoRV (New England Biolabs, Reino Unido) para diferençar entre Haemoproteus spp. e Plasmodium spp., seguindo o protocolo de Kistler et al. (2013).
Adicionalmente, as amostras positivas serão selecionadas aleatoriamente para sequenciamento, utilizando o BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher, EUA) em um sequenciador ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EUA). As sequências serão editadas com o software BioEdit e comparadas com o banco de dados GenBank utilizando a ferramenta BLAST. Uma árvore filogenética será construída no software MEGA6, aplicando o método de máxima verossimilhança com 1.000 replicatas bootstrap para estimar relações evolutivas entre as sequências obtidas e referências disponíveis.

Indicadores, Metas e Resultados

Indicadores:
• Número de aves de rapina atendidas e avaliadas clínica e laboratorialmente.
• Quantidade de amostras submetidas a diagnóstico molecular para hemosporídeos.
• Número de necropsias com análise histopatológica e molecular realizadas.
• Taxa de infecção por hemosporídeos (geral e por gênero: Plasmodium, Haemoproteus, Leucocytozoon).
• Número de linhagens parasitárias identificadas por sequenciamento.
• Relação entre grau de parasitemia e alterações hematológicas/bioquímicas.
• Comparação do tempo médio de internação entre aves infectadas e não infectadas.
• Número de artigos científicos submetidos a periódicos indexados.
• Participações em eventos científicos com apresentação de resultados.
• Elaboração de relatório técnico com recomendações para manejo e conservação.

Metas:
• Avaliar clínica e laboratorialmente pelo menos 60 aves de rapina admitidas no NURFS-CETAS/UFPel.
• Realizar análise molecular (PCR e sequenciamento) em amostras de sangue de ao menos 80% das aves vivas admitidas.
• Executar necropsias com análise histopatológica e molecular em pelo menos 10 aves que venham a óbito ou sejam eutanasiadas.
• Determinar a prevalência geral de infecção por hemosporídeos em aves de rapina da região estudada.
• Identificar e caracterizar geneticamente linhagens de hemosporídeos presentes nas aves analisadas.
• Estabelecer correlações entre a carga parasitária e os parâmetros laboratoriais (hematológicos e bioquímicos).
• Avaliar a influência da infecção por hemosporídeos no tempo de internação das aves reabilitadas.
• Submeter pelo menos 2 artigos científicos com os resultados obtidos.
• Apresentar os resultados em pelo menos 2 eventos científicos (nacionais ou internacionais).
• Elaborar um relatório técnico com diretrizes para diagnóstico, manejo clínico e estratégias de conservação.

Resultados Esperados:
• Geração de dados epidemiológicos atualizados sobre a infecção por hemosporídeos em aves de rapina do sul do Brasil.
• Identificação de linhagens parasitárias circulantes e possível descrição de variantes ainda não registradas.
• Maior compreensão dos efeitos clínicos, laboratoriais e patológicos da infecção por hemosporídeos nessas aves.
• Evidências científicas sobre a influência da infecção no tempo de reabilitação e prognóstico das aves atendidas.
• Subsídios para a melhoria dos protocolos de triagem, diagnóstico e tratamento em centros de reabilitação da fauna.
• Contribuição científica relevante por meio de publicações e apresentações em eventos da área.
• Apoio à conservação de aves de rapina por meio de recomendações técnicas baseadas em dados locais.
• Fortalecimento da vigilância sanitária de patógenos emergentes em ambientes naturais e antropizados.
• Formação de recursos humanos capacitados em diagnóstico e manejo de doenças em fauna silvestre.
• Integração entre pesquisa científica e políticas públicas voltadas à conservação da biodiversidade.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
FABIANE DE HOLLEBEN CAMOZZATO FADRIQUE
MARIA LUCIA ROSLER
RAQUELI TERESINHA FRANCA1

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