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O trigo (Triticum aestivum) é um dos cereais de maior importância mundial, pois desempenha papel fundamental na segurança alimentar de bilhões de pessoas. No cenário mundial, esta cultura ocupa o primeiro lugar em área cultivada e a segunda maior produção de grãos, sendo 219,1 milhões de hectares e 808,4 milhões de toneladas, respectivamente, na safra de 2022 (FAO, 2024). No Brasil, o trigo possui produção total superior a 8,2 milhões de toneladas e área semeada de cerca de 2,8 milhões de hectares na média dos últimos 5 anos, com destaque para a produção dos Estados da região Sul do país (CONAB, 2024).
O potencial produtivo do trigo é frequentemente afetado negativamente por estresses bióticos e abióticos que por diversos anos agrícolas causam prejuízos nas safras. Dentre os fatores bióticos, a competição imposta por plantas daninhas caracteriza-se como um dos mais relevantes, ocasionando perdas de cerca de 24% na produção total de grãos (Jabran et al., 2017), maturação desuniforme, diminuição na produtividade da cultura devido à competição por recursos do meio, redução da qualidade dos grãos, complicações na operação da colheita, e ainda podem se tornar hospedeiras de insetos e doenças (Agostinetto et al., 2015).
Visando controlar plantas daninhas, existem vários métodos disponíveis, o mais comum é o controle químico com o uso de herbicidas, por conta da sua facilidade de manejo, eficácia e baixo custo em comparação com outras ferramentas disponíveis. Na cultura do trigo, a dificuldade em controlar plantas daninhas durante a fase de pós-emergência deve-se, principalmente, ao fato de muitas espécies serem resistentes aos herbicidas registrados, como é o caso do azevém.
O azevém (Lolium multiflorum) é uma planta que se destaca por ser uma das mais competitivas, pois pertence a mesma família botânica do trigo, e por conta disso, possui necessidades semelhantes de recursos. No Brasil, já foram identificados biótipos de azevém que apresentam resistência aos herbicidas inibidores de EPSPs, ACCase e ALS. (Roman et al.; Vargas et al.; Mariani et al., 2004, 2013, 2015), portanto controlar esta daninha tem se tornado cada vez mais complexo, já que a ocorrência de resistência múltipla dificulta o controle químico e restringe as opções de controle alternativo.
Um método alternativo consiste no cultivo de genótipos de trigo com elevada capacidade competitiva, sendo esta uma ferramenta importante para complementar o método de manejo cultural de plantas daninhas. A competitividade das plantas daninhas inclui diversas características agronômicas, como alto vigor inicial (Hendriks et al., 2022), acúmulo de biomassa, boa capacidade de afilhamento, estatura da planta superior e cobertura do solo (Andrew et al.; Lemerle et al., 2015, 2001). Ainda, as habilidades competitivas das culturas agrícolas com as plantas daninhas permitem desenvolver estratégias de inserção em sistemas de manejo integrado, propiciar o uso racional de herbicidas, reduzir custos de produção, minimizar impactos ambientais e prevenir o surgimento de novos casos de plantas resistentes (Lamego et al., 2013).
Diferentes estudos têm sido conduzidos para elucidar os mecanismos de resposta a estresses bióticos em plantas. Dentre os avanços obtidos, pode-se destacar o envolvimento de genes relacionados a luz (Horvath et al., 2015), a resposta ao estresse oxidativo e processos de transporte (Horvath et al. 2019). No entanto, estas pesquisas foram conduzidas em outras culturas agrícolas, deste modo, tornando importante espelha-las no trigo, visando identificar possíveis genes candidatos que estejam envolvidos no aumento da habilidade competitiva das cultivares.
Diante da importância do trigo em nível social e econômico, e os prejuízos acarretados pela interferência de plantas daninhas na cultura, identificar e analisar as características que contribuem para que a planta se torne mais competitiva é essencial.

O projeto será dividido em três estudos, com experimentos conduzidos a campo, em casa de vegetação e no laboratório de biologia molecular.

Estudo I: Caracterização morfofisiológica de cultivares de trigo em convivência com azevém.

O experimento será realizado em campo, adotando o delineamento experimental de blocos casualizados em faixas, com esquema fatorial 2 x 12, com quatro repetições, e unidades experimentais representadas por parcelas de 7,65m² (1,53m x 5m). No fator A estarão alocados dois níveis de competição, sendo eles presença e ausência de azevém, e no fator B serão 12 genótipos de trigo com ciclos e estaturas distintas (TBIO Calibre, TBIO Astro, BIOTRIGO Talismã, TBIO Trunfo, BR 23, ORS Feroz, BIOTRIGO Titan, TBIO Aton, BIO 192118, BIO 192098, TBIO Ponteiro, BIOTRIGO Sentinela).
A semeadura do trigo será realizada de acordo com as recomendações para a cultura. A adubação será realizada com base no Manual de Calagem e Adubação para os Estados do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina. Os demais manejos culturais serão realizados de acordo com as Informações Técnicas para Trigo e Triticale (Reunião da Comissão Brasileira de Pesquisa de Trigo e Triticale, 2022).
A área experimental possui histórico de azevém, portanto este nível de competição estará presente através do banco de sementes e suplementado com 15 kg por hectare da planta daninha. Já a condição de ausência de competição, será obtida por meio da utilização de controle químico em pré-emergência com aplicação do herbicida piroxasulfona (Yamato) na dose de 250 mL/ha-1 e em pós-emergência com pinoxaden (Axial) na dose de 1 L/ha-1.
As características que serão avaliadas neste estudo são: matéria seca da parte aérea (MSPA), número de afilhos, índice de área foliar (IAF), clorofila, estatura e produtividade de grãos. Ainda, na pré-colheita serão colhidas as plantas presentes em um metro da unidade experimental para quantificar o número de espigas por m2 e o número de grãos por espiga.
Os dados obtidos serão submetidos a análise de variância e em caso de significância, as médias do fator A serão comparadas pelo teste t, e do fator B pelo teste de Scott-knott (p≤0,05).

Estudo II: Avaliação das características genéticas de cultivares de trigo em competição com azevém.

Extração de RNA e síntese de cDNA
Para extração de RNA será utilizado tampão de extração comercial, de acordo com as recomendações do fabricante. A quantidade e qualidade do RNA será acessada através do espectrofotômetro Nanovue e a integridade do RNA será analisada em gel de agarose 1%. Posteriormente, as amostras de RNA serão submetidas a digestão de DNAs contaminantes utilizando a enzima DNAse. Após verificação da eficiência da digestão do DNA via PCR, o RNA será convertido em cDNA através do kit comercial SuperScript® III first-strand system for RT-PCR.

Perfil transcricional
Para avaliar o perfil transcricional dos genes, as sequências correspondentes a região codificadora de cada gene será extraída do banco de dados Phytozome. Os primers serão desenhados utilizando o programa Primer3Plus, de acordo com os seguintes parâmetros: fragmento amplificado com tamanho de 50-150pb, temperatura de anelamento ~60ºC, conteúdo de GC de 40-60%.
A análise de expressão via PCR quantitativa em tempo real de transcrição reversa (RT-qPCR) será realizada de acordo com o manual MIQE (Bustin et al. 2009) utilizando equipamento LightCycler ® 480 Instrument II. Será realizada uma etapa de validação que busca determinar a eficiência de amplificação e a especificidade de cada primer. Somente os primers que apresentarem eficiência de 90 a 110% e um único pico na curva de dissociação serão utilizados. Os experimentos de expressão gênica serão realizados empregando o corante SYBR Green mix, e a quantificação será conduzida de acordo com o método ΔΔCt (Livak & Schmittgen 2001). Além dos primers correspondentes aos genes alvo, serão testados quatro primers de genes de normalizadores e os dados de expressão serão submetidos à análise de estabilidade no programa DataAssist™ v3.0. Após a análise, os três genes que apresentarem valores de score abaixo de 1,5 serão utilizados para normalizar os dados de expressão dos genes alvo.
Os dados de expressão gênica serão apresentados em gráficos com desvio padrão, e para a plotagem dos gráficos será utilizado o programa SigmaPlot 12.

Quantificação das enzimas antioxidantes
Para determinar a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), ascorbato peroxidase (APX) e catalase (CAT), será realizada uma extração com 0,2 g de amostra macerada em almofariz de porcelana na presença de nitrogênio líquido e 0,02 g de polivinilpirrolidona (PVP). Na sequência, serão adicionados 900 µL de tampão fosfato 200 mM (pH 7,8), 18 µL de EDTA 10 mM, 180 µL de ácido ascórbico 200 mM e 702 µL de água ultrapura e centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 20 minutos. A partir deste extrato, a quantidade de proteína nas amostras será determinada pelo método de Bradford (1976), adicionando-se 60 µL do extrato em 2 mL da solução de Bradford, e medindo a absorbância em um comprimento de onda de 595 nm. Será elaborada a curva padrão com globulina e os resultados serão expressos em miligramas de proteína por grama de matéria fresca.
A atividade da catalase será determinada pelo consumo de H2O2 (coeficiente de extinção de 39,4 mM cm⁻¹). A mistura de reação terá 1 mL de tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 7,0), 850 µL de água ultrapura, 100 µL de peróxido de hidrogênio 250 mM e 50 µL do extrato. A absorbância será medida em espectrofotômetro (Ultrospec 6300 Pro UV/Visível – Amersham Bioscience), no comprimento de onda de 240 nm durante 90 segundos, com leituras a cada 7 segundos.
A atividade da ascorbato peroxidase será determinada pelo consumo de H2O2 (coeficiente de extinção 2,9mM cm-1). Para isso, a mistura de reação terá 1mL de tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 7,0), 750 µL de água ultrapura, 100 µL de ácido ascórbico 10 mM, 100 µL de peróxido de hidrogênio 2 mM e 50 µL do extrato. A absorbância será medida no comprimento de onda de 290 nm, durante 90 segundos, com leituras em intervalos de 7 segundos. Para os cálculos da atividade tanto da CAT quanto da APX, será considerado que o decréscimo de uma unidade de absorbância é equivalente a uma unidade ativa (UA). As atividades do extrato total serão determinadas a partir da quantidade de extrato que reduziu a leitura de absorbância em uma UA, e expressas em UA mg⁻¹ de proteína por minuto⁻¹.
A determinação da atividade da superóxido dismutase será segundo metodologia adaptada de Peixoto et al. (1999), a partir Del Longo et al. (1993) e Giannopolitis e Ries (1977). Através deste método, será determinada a inibição da redução do NBT (ρ-nitro blue tetrazolium) pelo extrato enzimático, evitando-se assim, a formação do cromóforo. Neste ensaio, uma unidade de atividade enzimática (UA) de SOD será considerada como a quantidade de enzima necessária para se obter 50% de inibição da redução do NBT pela SOD contida no extrato enzimático. Para a reação, será adicionado no tubo de ensaio 1mL de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,8), 400 µL de metionina 70 mM, 20 µL de EDTA 10 µM, 390 µL de água ultrapura, 150 µL de NBT 1mM, 20 µL de riboflavina 0,2 mM e 20 µL de extrato. Na sequência, os tubos serão incubados em câmara iluminada com lâmpada fluorescente de 15 Watts, durante 10 minutos, sendo então realizada a leitura da absorbância no comprimento de onda de 560 nm. Para efeito de cálculo, o branco da reação consistirá em tubos de ensaio sem extratos, expostos e não expostos à luz. A atividade será determinada pela quantidade de extrato necessária para inibir 50% da reação de NBT e expressa em UA mg-1 proteína minuto-1.
Os dados obtidos serão analisados quanto à normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e à homocedasticidade pelo teste de Hartley, e na sequência, serão submetidos à análise de variância (p0,05).

Estudo III: Análise da velocidade de emergência e crescimento inicial de cultivares de trigo e do azevém.

O experimento será realizado em casa de vegetação em delineamento adotado será inteiramente casualizado, com cinco repetições. Os tratamentos serão compostos por doze cultivares de trigo (Biotrigo Sentinela, TBIO Ponteiro, BIO 192098, BIO 192118, TBIO Aton, Biotrigo Titan, TBIO Trunfo, Biotrigo Talismã, ORS Feroz, BR 23, TBIO Astro e TBIO Calibre) e azevém. A quantidade de sementes por vaso será ajustada para cada cultivar de acordo com seu poder germinativo, determinado através do teste de germinação em laboratório, visando o estabelecimento de 20 plantas por vaso. A profundidade de semeadura será uniformizada em 1,5 cm.
Serão avaliadas as variáveis: índice de velocidade de emergência (IVE), massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca da raiz (MSR), índice de área foliar e estatura das plantas. Para avaliar o IVE, será realizada a contagem diária das plântulas emergidas com parte aérea superior a 1,5 cm, até o décimo dia após a semeadura. O cálculo do IVE será realizado utilizando a equação proposta por Popinigis (1977), que consiste em: IVE = N1/D1 + N2/D2 +... Nn/Dn, onde: N1= número de plântulas emergidas no primeiro dia; Nn= número acumulado de plântulas emergidas no décimo dia; D1= primeiro dia de contagem; e Dn= quantidade de dias contados após a semeadura.
Aos 35 DAE será aferida a estatura por meio da medição do comprimento da planta partindo do nível do solo até o ápice; será medida a área foliar com o auxílio de um determinador de área foliar (Area Meter 3100); e ainda, serão realizadas as avaliações da MSPA e MSR, na qual os tecidos coletados serão alocados em estufa a 60 °C até atingirem massa constante.
Os dados obtidos serão submetidos a análise de variância e as médias dos tratamentos serão comparadas através do teste de Duncan. Em ambas as análises, será adotado o nível de 5% de probabilidade.

Identificar novos genes e analisar seus padrões de expressão em resposta a competição com plantas daninhas;
Estabelecer critérios para a seleção de plantas de trigo que apresentem maior habilidade competitiva em relação a plantas daninhas;
Buscar financiamento em órgão de fomento de pesquisa;
Elaborar artigos científicos (2) e resumos (2) visando a divulgação dos resultados para a sociedade.