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15/10/2018 - 31/12/2021

Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal

Cinquenta ovários equinos serão coletados em abatedouro e mantidos em solução salina estéril em temperatura entre 32ºC e 35ºC, sendo assim transportados para o laboratório. Após a chegada, os folículos de diâmetro entre 10mm e 30mm serão aspirados, tendo o complexos-cumulus ovócitos (CCOs) analisado morfologicamente e classificados em dois grupos: compactos (Cp) e expandidos (Ex). No primeiro experimento, uma amostragem de cada grupo de CCOs será imediatamente submetida a avaliação gênica utilizando métodos de biologia molecular de extração de mRNA para subsequente expressão gênica com uso de qRT-PCR para determinar os fatores que indicam a viabilidade celular. Além disto, os CCOs, ovócitos e células do cúmulos serão avaliados para determinar o nível de apoptose envolvido na competência ovocitaria através da avaliação dos genes BCL2 e BAX. Além disso, uma amostragem de CCOs será preservada em solução bloqueadora para verificação da integridade estrutural do ovócito que será realizada com a utilização de sondas fluorescentes. Microfilamentos, microtúbulos e cromatina serão avaliados pela técnica de imunomarcação. A integridade nuclear do ovócito pode ser avaliada com sua exposição em 10 g/ml de iodeto de propídio (PI) durante 5 min. A migração de grânulos corticais (GCs) do centro para a periferia do ovócito pode ser usada como um indicador de maturação citoplasmática. Após a coloração, os ovócitos serão armazenados em lâminas com meio de montagem anti-descolorador para análise pela técnica de microscopia confocal. O processamento e análise das células pela técnica de microscopia confocal será realizada no Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS (CME/UFRGS). Os ovócitos não mostrando nenhum sinal de desenvolvimento nuclear serão classificados como estágio de vesícula germinativa (VG). Ovócitos tendo uma configuração condensada da cromatina e os GCs no córtex do ovócito serão caracterizados como metáfase-I (M-I). A presença do cromossoma alinhado na placa metafásica e GCs na periferia do ovócito serão classificados como metáfase-II (M-II). Os demais CCOs serão criopreservados utilizando diferentes protocolos de criopreservação. Para o segundo experimento, os ovócitos serão submetidos ao mesmo protocolo do experimento 1, porém os CCOs serão submetidos a maturação in vitro (MIV).